桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒
特別提示:包括桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒
英文名稱:Taura Syndrome Virus(TSV)
產(chǎn)品規(guī)格:50次
產(chǎn)品保存:-20℃保存
產(chǎn)品有效期:一年
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸:低溫、避光,快遞免費(fèi)送貨上門。
桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒產(chǎn)品及特點:
因此快速靈敏檢測桃拉綜合癥病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 引物經(jīng)過精心優(yōu)化,專一性強(qiáng),只擴(kuò)增桃拉綜合癥病毒,與其他植物沒有交叉反應(yīng)。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次,但只能用于科研。
桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒規(guī)格及成分:
運(yùn)輸及保存:低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為一年。陽性對照需要單獨(dú)放置,不要污染其他試劑。
自備試劑:樣品 DNA。
桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒使用方法:
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈送20 次核酸釋放劑試用裝,其使用手冊可以從本公司網(wǎng)站訂購核酸釋放劑。
2. 如果有 N 個樣品,則需要做 N+2 個提取,包括一個樣品制備陽性對照和一個樣品制備陰性對照。樣品制備陽性對照是在適量水(取決于試劑盒要求的樣品起始量)中加 10μL 桃拉綜合癥病毒 PCR 陽性對照的 1000 倍稀釋液而得,樣品制備陰性對照是直接用水。提取結(jié)束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、設(shè)置 PCR 反應(yīng)(40μL 體系)
3. 對 N+2 個樣品,在 PCR 時需要增加一個 PCR 陽性對照和一個 PCR 陰性對照,故需要設(shè)置 N+4 個反應(yīng)。在 N+4 個 PCR 管中分別加入下列成分:
4. 按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng):
三、電泳檢測
5. 取 10-20 μL PCR 產(chǎn)物。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的 PCR Mix在擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣,不需要另外再加 loading buffer。PCR 產(chǎn)物陽性對照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn),陰性對照必須無任何擴(kuò)增,否則實驗無效。對沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品,可以稀釋 10 倍后重復(fù) PCR 擴(kuò)增以排除 PCR 抑制劑的感染。
PCR常見問題的常見原因
1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因:
1) RNA模板質(zhì)量低
2)對mRNA濃度估計過高
3) 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
4) 同位素磷32過期
5) 反應(yīng)體積過大,不應(yīng)超過50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
1) 最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
2)與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)
3)建議在試驗中加入對照RNA
4)鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10
5)建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(GSP)用于鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu),如環(huán)狀結(jié)果,有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火;或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。
6)目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點,可以試用以下方法解決:
a. 將鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行鏈反應(yīng)。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
1) 用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶,則需要用DNase I重新處理樣品。
2) 在PCR反應(yīng)中,非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火,降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同,根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶
1) 在PCR反應(yīng)體系中鏈產(chǎn)物的含量過高
2) 減少引物的用量
3) 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
4) 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時,其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,一般會顯示為彌散背景。
5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
1) 大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
2) 對于長片段的PCR,建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)
6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下,對照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果
關(guān)鍵字: 桃拉綜合癥病毒PCR試劑盒;PCR試劑盒
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