庫(kù)蚊通用PCR試劑盒

特別提示：包括庫(kù)蚊通用PCR試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
產(chǎn)品名稱：庫(kù)蚊通用PCR試劑盒
英文名稱：Culex spp.
產(chǎn)品規(guī)格：50次
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門(mén)。

庫(kù)蚊通用PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn):
因此快速靈敏檢測(cè)庫(kù)蚊通用具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開(kāi)發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 引物經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增庫(kù)蚊通用，與其他植物沒(méi)有交叉反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。
5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。
庫(kù)蚊通用PCR試劑盒規(guī)格及成分:

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽(yáng)性對(duì)照需要單獨(dú)放置，不要污染其他試劑。
自備試劑：樣品 DNA。
庫(kù)蚊通用PCR試劑盒使用方法：
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20 次核酸釋放劑試用裝，其使用手冊(cè)可以從本公司網(wǎng)站訂購(gòu)核酸釋放劑。
2. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要做 N+2 個(gè)提取，包括一個(gè)樣品制備陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)樣品制備陰性對(duì)照。樣品制備陽(yáng)性對(duì)照是在適量水（取決于試劑盒要求的樣品起始量）中加 10μL 庫(kù)蚊通用 PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液而得，樣品制備陰性對(duì)照是直接用水。提取結(jié)束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、設(shè)置 PCR 反應(yīng)（40μL 體系）
3. 對(duì) N+2 個(gè)樣品，在 PCR 時(shí)需要增加一個(gè) PCR 陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè) PCR 陰性對(duì)照，故需要設(shè)置 N+4 個(gè)反應(yīng)。在 N+4 個(gè) PCR 管中分別加入下列成分：

4. 按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)：

三、電泳檢測(cè)
5. 取 10-20 μL PCR 產(chǎn)物。電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的 PCR Mix在擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加 loading buffer。PCR 產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照必須無(wú)任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。對(duì)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋 10 倍后重復(fù) PCR 擴(kuò)增以排除 PCR 抑制劑的感染。
PCR常見(jiàn)問(wèn)題的常見(jiàn)原因
1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：
1) RNA模板質(zhì)量低
2）對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高
3) 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
4) 同位素磷32過(guò)期
5) 反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
1) 最常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
2）與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
3）建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA
4）鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10
5）建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
6）目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行鏈反應(yīng)。

3. 產(chǎn)生非特異性條帶
1) 用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
2) 在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
3) 由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶
1) 在PCR反應(yīng)體系中鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高
2) 減少引物的用量
3) 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
4) 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。
5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
1) 大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
2) 對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）
6. 在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果