上海澤葉生物科技有限公司專注高品質(zhì)的免疫學(xué)產(chǎn)品并代理：sigma，R&D,BD,CST,abcam,eBioscince,santa,PeproTech,BioVision,Mabtech,Bethyl?Biolegend , DB Biotech,American Research, Rockland, Fitzgerald等知名品牌的產(chǎn)品提供針對(duì)人源,大鼠，小鼠等種屬蛋白的多種單抗及多抗產(chǎn)品，可以應(yīng)用于多種實(shí)驗(yàn)。 一，動(dòng)物的免疫選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ (一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn))
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
│ (ip劑量不宜超過0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ (5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果)
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。
二，融合與篩選最重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過程中最難的一步了。
(一) 細(xì)胞融合流程
1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
6 在室溫下融合:
①30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。
?、邸〖宇A(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
9 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
三、抗體的鑒定篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面