產(chǎn)品簡介

線粒體是細胞呼吸的主要場所，細胞活動所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進行的氧化所產(chǎn)生的能量來供應。制備線粒體的關鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級分離法獲得，即先低俗出去細胞核以及細胞碎片，再進行高速梯度離心分離線粒體。

細胞線粒體分離試劑盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離培養(yǎng)細胞中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素 C 等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

本試劑盒提供了蛋白酶抑制劑PMSF，使勻漿時蛋白酶的活性被適當抑制，這樣在獲得線粒體的同時還可以獲得有時有用的去除了大量線粒體的蛋白，在進行蛋白或酶活分析時可以作為對照

該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

試劑組分

試劑(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃
試劑(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光（可選）
試劑(C): Wash buffer 100ml -20℃
試劑(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃
試劑(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT
試劑(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃

有效期： 12 個月有效。

自備材料：1、 胰蛋白酶；2、 低溫離心機、勻漿器；3、 PBS；

操作步驟 (僅供參考) ：

1、清洗：用預冷的 PBS 清洗細胞 1 次，4℃ 1000g 離心 5min，棄上清。

2、裂解：沉淀用 1～2ml 預冷的 Mitochondria Lysis buffer 重懸細胞，冰浴放置 10～15min，可用相差顯微鏡檢測膨脹的程度。

3、勻漿：把細胞懸液轉(zhuǎn)移至勻漿器中，勻漿 10～20 次。不同細胞或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

4、立即取勻漿液，加入等量 Wash buffer，輕輕顛倒混勻數(shù)次。

5、4℃，1300g 離心 5min 以去除細胞核、未破碎的細胞和大的膜碎片。

6、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 1000g 離心 5min，重復 2 次。

7、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 12000～15000g 離心 15min，重復 1 次。

8、棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清 12000g，4℃離心 10min，上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。獲得的細胞漿蛋白應保存于 1×Protein Stock buffer，即按細胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應使用恰當?shù)谋４嬉骸?/span>

9、保存：棄上清，用適當緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應重懸于 Mitochondria Stock buffer；如果用于雙向電泳，請使用適當?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。

注意事項

1、試劑(如臺盼藍染色液)對于不同實驗不必全部使用，在實驗條件成熟后可以不必使用。

2、如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer 中不必加入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer中需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入，使PMSF的最終濃度為1mM，以免 PMSF在水溶液中很快失效。

3、分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進行，所用溶液需冰浴或 4℃預冷，全部操作時間盡量控制在 1h 以內(nèi)。

4、通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取 1000g 和 15000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。

5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。