注意事項(xiàng)?
本產(chǎn)品為凍干粉形式，使用前請(qǐng)瞬時(shí)離心，加適當(dāng)溶劑溶解后使用。?
儲(chǔ)存條件?
-20℃干燥、避光保存，自收貨之日起一年有效。若配制成水溶液，應(yīng)小量分裝保存。

產(chǎn)品介紹?
鬼筆環(huán)肽是從致命的傘形毒蕈蘑菇中分離出來(lái)的一種毒素。 它是特異性結(jié)合于F-肌動(dòng)蛋白的雙環(huán)肽（1）。因此用熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以非常方便的研究F-肌動(dòng)蛋白的分布。鬼筆環(huán)肽內(nèi)部，在半胱氨酸和色氨酸之間含有不常見(jiàn)的硫醚橋形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。 在pH升高時(shí)，該硫醚被裂解，鬼筆環(huán)肽失去對(duì)肌動(dòng)蛋白的親和力。
? ? 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可在納摩爾水平染色F-肌動(dòng)蛋白（1-3）。在各種植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)大、小細(xì)絲具有相似的親和力，平均每個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基結(jié)合一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子。不同于抗體，鬼筆環(huán)肽與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合親和力在不同物種間沒(méi)有顯著變化。非特異性染色可以忽略不計(jì)，染色和未染色區(qū)域之間的對(duì)比度非常大。鬼筆環(huán)肽將單體/聚合物的平衡轉(zhuǎn)向聚合狀態(tài)，將聚合臨界濃度降低至30倍（3,4）。Phallotoxins可通過(guò)抑制細(xì)胞松弛素的解聚，碘化鉀和升高的溫度，穩(wěn)定F-肌動(dòng)蛋白，。因?yàn)楣砉P環(huán)肽綴合物很小，大約直徑12-15埃，分子量<2000道爾頓，多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌鈣蛋白依然可以和鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白結(jié)合。更重要的是，鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲保持功能，標(biāo)記甘油肌纖維仍然收縮，標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲仍然可以繼續(xù)移動(dòng)（5,6）。而且熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可用于對(duì)細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行定量研究（7,8）。
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實(shí)驗(yàn)方法?
儲(chǔ)液制備?
熒光染料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽：取適量甲醇或無(wú)菌水溶解棕色管中凍干的粉末，制備成200U/mL的儲(chǔ)液（300T規(guī)格染料加入1.5mL的液體）。?
熒光標(biāo)記的標(biāo)記鬼筆環(huán)肽的一個(gè)單位（T）的定義是染色一個(gè)加載細(xì)胞的載玻片所用染料的量。使用時(shí)的推薦稀釋比例為1:40-1:200，一個(gè)單位相當(dāng)于200μL總?cè)旧w積中加入1-5μL 200U /mL儲(chǔ)備溶液。?

注：稀釋比例可以根據(jù)實(shí)際染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

固定細(xì)胞染色?
以下方案是針對(duì)生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片或8孔室玻片上的貼壁細(xì)胞的染色步驟。鬼筆環(huán)肽也可用于染色固定的冷凍或石蠟組織切片。?
1. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
2 . 用含有3.75％甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞，冰上固定15分鐘。?
注意：甲醇可以在固定過(guò)程中破壞肌動(dòng)蛋白。因此避免含有任何甲醇的固定劑。優(yōu)選的固定劑是不含甲醇的甲醛。?
3. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
4. 用含0.5％Triton X-100的PBS溶液在室溫下透化細(xì)胞10分鐘。?
5. 用PBS清洗細(xì)胞3次。?
6. 用200μL PBS稀釋1-5μL熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)液，加入一個(gè)蓋玻片或孔中，室溫孵育20min，進(jìn)行染色。?
注：染色體積可根據(jù)樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。孵育過(guò)程中為避免染液揮發(fā)，可將蓋玻片放于密封容器內(nèi)。?
7. 用PBS清洗細(xì)胞2-3次。?
8. 熒光顯微鏡觀(guān)察。此產(chǎn)品具有很好的光穩(wěn)定，樣品可以在PBS中成像，但為了效果，也可以使用抗熒光淬滅劑觀(guān)察。?
活細(xì)胞染色?
熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性，因此沒(méi)有被廣范用于活細(xì)胞標(biāo)記。 然而，有報(bào)道稱(chēng)活細(xì)胞可能通過(guò)胞飲或未知機(jī)制進(jìn)行標(biāo)記（9-12）。 一般來(lái)說(shuō)，染色活細(xì)胞時(shí)需要更多的染料。 或者熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可被注入到細(xì)胞中用于監(jiān)測(cè)肌動(dòng)蛋白分布和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（13-16）。

Reference?
1.Wieland, T. in Phallotoxins, Springer-Verlag, New York (1986);?
2. J Muscle Res Cell Motil 9, 370 (1988);?
3. Methods Enzymol 85, 514 (1982);?
4. Eur J Biochem 165, 125 (1987);?
5. Nature 326, 805 (1987);?
6. Proc Natl Acad Sci USA 83, 6272 (1986);?
7. Blood 69, 945 (1987);?
8. Anal Biochem 200, 199 (1992);?
9. J Cell Biol 105, 1473 (1987);?
10. Proc Natl Acad Sci USA 77, 980 (1980);?
11. Nature 284, 405 (1980);?
12. CRC Crit Rev Biochem 5, 185 (1978);?
13. J Cell Biol 106, 1229 (1988);?
14. J Cell Biol 103, 265a (1986);?
15. Eur J Cell Biol 24, 176 (1981);?
16. Proc Natl Acad Sci USA 74, 5613 (1977)