上海澤葉生物科技有限公司專注高品質的免疫學產品并代理:sigma,R&D,BD,CST,abcam,eBioscince,santa,PeproTech,BioVision,Mabtech,Bethyl?Biolegend , DB Biotech,American Research, Rockland, Fitzgerald等知名品牌的產品提供針對人源,大鼠,小鼠等種屬蛋白的多種單抗及多抗產品,可以應用于多種實驗。 一,動物的免疫選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功,獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫,免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強,不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:
2. 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐劑,常用佐劑:福氏完全佐劑,福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起,研磨成油包水的乳糜狀,放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖,使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐劑皮下多點注射
│ (一般0.8~1ml 0.2ml/點)
↓3周后
第二次免疫 劑量同上,加福氏不完全佐劑皮下或ip
│ (ip劑量不宜超過0.5ml)
↓3周后
第三次免疫 劑量同上,不加佐劑,ip
│ (5~7天后采血測其效價,檢測免疫效果)
↓2~3周后
加強免疫,劑量50~500μg為宜,ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前,用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新,如①將可溶性抗原顆?;蚬滔嗷环矫嬖鰪娏丝乖拿庖咴?,另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑,基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑,提高機體的免疫應答水平,促進免疫細胞對抗原反應性。
二,融合與篩選最重要的一步是融合,我想這也是單抗制備過程中最難的一步了。
(一) 細胞融合流程
1 取對數生長的骨髓瘤細胞SP2/0,1000rpm離心5分鐘,棄上清,用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數,取所需的細胞數,用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時制備免疫脾細胞懸液,用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料離心管內用不完全培養(yǎng)液洗1次,1200rpm,8分鐘。
4 棄上清,用滴管吸凈殘留液體,以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底,使細胞沉淀略加松動。
6 在室溫下融合:
①30秒內加入預熱的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,邊加邊攪拌。
?、凇∽饔?0秒鐘,若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。
③ 加預熱的不完全培養(yǎng)液,終止PEG作用,每隔2分鐘分別加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。
7 離心,800rpm,6分鐘。
8 棄上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640輕輕混懸,切記不能用力吹打,以免使融合在一起的細胞散開。
9 根據所用96孔培養(yǎng)板的數量,補加完全培養(yǎng)液,10ml一塊96孔板。
10 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板,100μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。
三、抗體的鑒定篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中,僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面