上海澤葉生物科技有限公司專注高品質(zhì)的免疫學(xué)產(chǎn)品并代理：sigma，R&D,BD,CST,abcam,eBioscince,santa,PeproTech,BioVision,Mabtech,Bethyl?Biolegend , DB Biotech,American Research, Rockland, Fitzgerald等知名品牌的產(chǎn)品提供針對人源,大鼠，小鼠等種屬蛋白的多種單抗及多抗產(chǎn)品，可以應(yīng)用于多種實驗。
一，動物的免疫
選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
　　1.　顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐劑皮下多點注射
　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／點)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　第二次免疫　劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip
　　　　　　　　│　　　　　　　(ip劑量不宜超過0.5ml)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　　第三次免疫　劑量同上，不加佐劑，ip
　　　　　　　　│ (5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)
　　　　　　　　↓2～3周后
　　　　　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
　　　　　　　　↓3天后
　　　　　　　取脾融合
　　目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，促進免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。
二，融合與篩選
最重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過程中最難的一步了。
　(一)　細(xì)胞融合流程
　　1　取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
　　2　同時制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
　　3　將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
　　4　棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
　　5　輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。
　　6　在室溫下融合:
①30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。
　?、凇∽饔?0秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。
　?、邸〖宇A(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
　　7　離心，800rpm，6分鐘。
　　8　棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。
　　9　根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
　　10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
　　一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
三、抗體的鑒定
篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面