酵母基因組DNA提取試劑盒

Yeast DNA Kit

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

室溫保存，12個(gè)月內(nèi)有效。Proteinase K與Lyticase-20℃保存。緩沖液 YBL與緩沖液 YL可能有沉淀產(chǎn)生，37度水浴溶解后即可。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

酵母DNA提取試劑盒(Yeast DNA Kit)采用了一種新型的硅膠柱。在特定條件下，使DNA能在離心過(guò)柱的瞬間，結(jié)合到純化柱上，在一定條件下又能將DNA充分洗脫，從而實(shí)現(xiàn)DNA的快速純化。無(wú)需酚氯仿抽提，無(wú)需酒精沉淀。純化的DNA可直接用于PCR、Southern雜交和酶切等。

● 準(zhǔn)備工作：

1. 準(zhǔn)備30℃，65℃，70℃水浴；無(wú)水乙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管

2. 按照標(biāo)簽所示在DNA Wash Buffer中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液YBL，緩沖液YL是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1. 取1-3 ml 酵母培養(yǎng)物（不超過(guò)3×10⁷ 酵母細(xì)胞），12,000 rpm (~13,400×g )離心1分鐘，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

注：可用分光光度計(jì)或平板培養(yǎng)法檢測(cè)菌體量，一般對(duì)于釀酒酵母OD₆₀₀值為1.0時(shí)，相當(dāng)于1-2×10⁷cell/ml。

2. 加入480 μl 緩沖液 SE，完全重懸細(xì)胞。加入30μl Lyticase溶液。30℃水浴處理30min。期間振蕩幾次。

注意：以處理時(shí)間為經(jīng)驗(yàn)值，根據(jù)酵母菌株和酵母細(xì)胞數(shù)量的不同，孵育時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。 

3. 4000 rpm(~1500×g)離心10鐘，棄上清，收集沉淀。加入200μl 緩沖液 YL重懸。加入50mg Glass Beads，劇烈渦旋5min。

4. 加入20μl  蛋白酶K，混勻。65℃水浴孵育直至裂解完全，孵育過(guò)程中，渦旋幾次。一般來(lái)說(shuō)1小時(shí)以?xún)?nèi)能徹底裂解。

5. 可選步驟：加入5μl RNaseA并反復(fù)顛倒混勻，在室溫條件下孵育5分鐘。

6. 12,000 rpm (~13,400×g )離心1分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。

7. 加入220 μl 緩沖液 YBL，振蕩15  秒，70℃放置10  分鐘，溶液應(yīng)變清亮。

注意：加緩沖液YBL 時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純。

8. 加220 μl 無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

9. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30  秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

10.  向吸附柱中加入500 μl  緩沖液 WB，12,000 rpm (~13,400×g )  離心30  秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

11. 向吸附柱  中加入600 μl DNA Wash Buffer（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )  離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

12.  向吸附柱中加入600 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

13. 12,000 rpm(~13,400×g)離心2 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

14.  將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μl  洗脫緩沖液EB或滅菌去離子水，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm (~13,400×g )  離心1分鐘，將溶液收集到離心管中。

注：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH  值在7.0-8.5  范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH  值調(diào)到此范圍)，pH  值低于7.0  會(huì)降低洗脫效率；

15. DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

● DNA濃度及純度檢測(cè)：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。