動(dòng)物/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：RTG2402）

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的蛋白酶K和RNaseA收到后按照需要分裝成小管，-20℃保存。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，能提取多種細(xì)胞/組織中的基因組DNA。離心吸附柱可以高效、專一吸附DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)。

● 提取得率：

● 準(zhǔn)備工作：

1. 準(zhǔn)備55℃和70℃水??；無(wú)水乙醇；1.5ml滅菌離心管。

2. 按照標(biāo)簽所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1. 處理材料：

a. 培養(yǎng)細(xì)胞：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液（如用PBS緩沖液或類似緩沖液），10,000 g離心1分鐘，倒盡上清，加入200 μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。

b. 組織：取約30mg動(dòng)物組織（脾組織用量應(yīng)少于10 mg）加入到事先盛有200μl 緩沖液GA的1.5ml離心管中，用研磨杵徹底將組織研碎。

2. 加入20 μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取細(xì)胞基因組時(shí)，加入蛋白酶K混勻后，55℃放置5-10分鐘。

b. 提取組織基因組時(shí)，加入蛋白酶K混勻后，在55℃放置，直至組織溶解。

注：不同組織裂解時(shí)間不同，通常需1-3小時(shí)即可完成（鼠尾需要消化過(guò)夜）,期間間歇顛倒混勻樣品。

3. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

4. 加入220 μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

注：加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置一段時(shí)間后會(huì)消失。如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，會(huì)影響DNA的純度和得率，而且可能導(dǎo)致步驟6中離心柱堵塞。

5．加入220 μl 無(wú)水乙醇，顛倒混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

注：加入乙醇后會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀，可用槍頭反復(fù)抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理，容易導(dǎo)致步驟6中離心柱的堵塞。

6．將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：如果出現(xiàn)吸附柱堵塞現(xiàn)象，可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到5分鐘。

7．向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

8．向吸附柱CG中加入700 μl 漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

9．向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液。

10．將吸附柱CG放回廢液收集管中，11,000g離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。

11．將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11,000g離心2分鐘。

注；1. 洗脫緩沖液體積不少于100 μl，體積過(guò)小影響回收效率。

2. 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

12. DNA產(chǎn)物-20℃保存。