一、免疫共沉淀實驗技術原理
免疫共沉淀（Co-IP）是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“prorein A"特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。
嘉美實驗免疫共沉淀實驗原理示意圖
二、實驗操作流程
1、樣品準備
1）取細胞加入500μl上樣Buffer(無溴酚藍)和50ul 10mg/ml PMSF，混勻，超聲波破碎細胞
2）4℃，12000rpm離心10min
3）取上清夜，-70℃凍存24hr
4）4℃ 12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。
2、定量蛋白及計算電泳上樣量：根據(jù)總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug
3、免疫沉淀
1）準備A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
2）準備A蛋白-Sepharose珠.一抗復合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm離心5 min，PBS洗滌3次，加50ulPBS
3）取100 μg總蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗復合物，4℃輕搖2h，PBS洗滌3次，之后加入50ul 1×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃變性3 min，以游離抗原、抗體、珠子，8000 rpm室溫離心5 min，蛋白上清儲于-20℃?zhèn)溆谩?/div>
4、電泳
1）安裝好電泳裝置
2）根據(jù)不同的指標配制相應濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封 (<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)
3）30min后，待凝后傾去封液
4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干
5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進行預處理)
6）緩慢加入內、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進入分離膠后，調電壓至150V繼續(xù)電泳
7）當指示劑距平板底端1cm處時停止電泳
5、轉膜及檢測
1）準備2個Φ12cm的平面皿，一個裝去離子水浸泡NC膜 20min，另一裝轉移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min
2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉移緩沖液中約 5min
3）按順序安裝好轉膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）
4）完全排除氣泡， 4℃，100mA轉膜2hr。
5）傾去轉膜緩沖液，拆除轉膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右
6）將膜轉移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜
7）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗
8）37℃搖床孵育約2hr
9）PBST洗滌4次，每次5min
10）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min
11）PBST洗滌4次，每次5min
12）將膜轉移至盡可能小的容器中并加入預先配制好的化學發(fā)光底物（A液與B液等體積混和），室溫孵育5min后
13）取出NC膜，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中顯影
14）掃描及分析
嘉美實驗免疫共沉淀實驗服務流程圖
三、標本保存及運輸
1、提供的樣品及量要求：新鮮或正確保存的組織、細胞或蛋白樣品，組織樣品：動物組織＞400mg/樣品，植物組織＞2g/樣品；細胞樣品：＞2×107 細胞數(shù)/樣品；蛋白樣品：裂解樣品總蛋白量＞2ml/樣品。
2、提供目的蛋白和互作蛋白的詳細信息，包括蛋白種屬、大小、參考文獻等。
3、嘉美實驗建議客戶提供目的蛋白陽性對照。
4、嘉美實驗提供免疫共沉淀所需一抗。
5、如果客戶提供，需要保證所需提供符合免疫共沉淀技術要求的濃縮或即用型抗體；若因客戶抗體原因導致實驗失敗，由此造成的損失由客戶承擔。
6、標本干冰寄送，并應避免各類污染和反復凍融。
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北京嘉美臻元生物技術有限公司（嘉美實驗）是一家專注于生命科學領域的高科技企業(yè)，公司創(chuàng)立于2005年，由在國內科研試劑、實驗技術、質量管理領域有著十幾年從業(yè)經(jīng)驗的專業(yè)、專家團隊組建而成；2009年在北京重組，先后成立了北京嘉美諾斯生物科技有限公司（主要開展生物相關產(chǎn)品進、出口業(yè)務），北京嘉美紐諾生物科技有限公司（主要為大型藥廠、診斷試劑公司提供服務）。為方便實驗服務項目開展，成立了北京嘉美臻元生物技術有限公司，以“嘉美實驗”品牌提供實驗外包服務。近五年來，公司已為全國各類科研用戶提供了近5000個大大小小的專項實驗外包或整體課題外包項目服務，實驗項目涵蓋了生命科學、醫(yī)學的各研究領域。經(jīng)過多年努力，公司已成為