實驗一、核染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）之——Chip-DNA
一、實驗原理
染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是一種適用于研究蛋白質與生物體細胞中DNA相互作用的經典方法，這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區(qū)段，研究體內轉錄因子和靶基因啟動子區(qū)域直接相互作用的方法，對于調控蛋白在基因組上的結合靶點篩選、差異化表觀遺傳變異的原理揭示提供了重要的解決思路。在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。
二、實驗步驟
1、樣品甲醛交聯(lián)固定、終止、收集樣品、裂解樣品
2、 超聲或者酶解處理樣品DNA成片段，瓊脂糖電泳檢測
3、樣品預處理：用Protein A/G Sepharose孵育
4、樣品與IP抗體進行孵育
5、洗滌Protein A/G Sepharose-Antibody-Protein Complex，并對免疫復合物進行變性處理，提取DNA樣品
6、檢測
1） 實時熒光定量PCR檢測
2） DNA芯片檢測
3） DNA產物測序
三、研究方向
1、篩選調控蛋白在基因組上的結合靶點：針對轉錄因子、DNA/RNA聚合酶、轉錄復合物等調控因子蛋白進行特異性的富集，分離純化與之結合的靶DNA片段并測序，分析篩選到準確有效的靶位點、靶基因數(shù)據；
2、揭示差異化表觀遺傳變異的原理：通過對不同表型組織內組蛋白、轉錄因子蛋白及其他結合蛋白進行染色質免疫共沉淀測序并定量分析靶基因表達調控水平或針對同種組蛋白進行甲基化、磷酸化、泛素化修飾所導致的結合位點變異進行分析，即可準確揭示差異化表觀變異原理；
3、研究表觀遺傳變異疾?。?/strong>借助染色質免疫共沉淀測序技術結合生物信息分析揭示由蛋白與DNA相互作用變異而引起的疾病的原理，明確表觀遺傳修飾在癌癥等表觀遺傳變異疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制。
四、結果提供
1、ChIP-DNA：分布在100～500bp范圍，且主要片段在～250bp；
2、總量≥5ng；
3、Input率；
4、陰性對照抗體對目的片段的富集程度小于檢測抗體2倍以上。
五、標本要求及其它要求
1、動物：細胞系、低脂肪含量組織液氮速凍樣本（細胞數(shù)大于5×106個）；
2、抗體：嘉美實驗提供?；蛘呖蛻暨M口IP級別抗體/非商業(yè)化標準抗體（需檢測）；
3、樣品運輸：干冰運輸，建議用滅菌的樣品袋或LoBind 管，parafilm將管口密封好；
4、目的基因或轉錄因子的相關背景資料。
實驗二、核染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）之——Chip-Seq
一、實驗原理
1、CHIP-seq，指的是結合位點分析法，作用為研究體內蛋白質與DNA相互作用。染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結合位點分析法，是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。
2、將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉淀技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。
二、實驗步驟
1）甲醛交聯(lián)整個細胞系（組織），即將目標蛋白與染色質連結起來；
2）分離基因組DNA，并用超聲波將其打斷成一定長度的小片段；
3）添加與目標蛋白質特異的抗體，該抗體與目標蛋白形成免疫沉淀免疫結合復合體；
4）去交聯(lián)，純化DNA即得到染色質免疫沉淀的DNA樣本，準備測序；
5）將準備好的樣本進行深度測序。
三、生物信息分析流程
1）將測序得到的短序列片段匹配到參考基因組序列上。
2）有一部分短序列不能匹配到參考基因組上，有可能是未知的基因組序列；另一部分是能夠匹配到基因組上的短序列，通常要對這些短序列進行覆蓋度計算。
3）從匹配到基因組上的短序列中進行富集區(qū)域的掃描。通常掃描到的富集區(qū)即被認為是蛋白質與DNA相互結合的區(qū)域（也有假陽性位點等的影響）。
4）對掃描到的富集區(qū)做深度分析，包括基因，GO注釋，利用基因瀏覽器進行可視化瀏覽，研究與基因結構的關系等。