IPTG介紹

 IPTG是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)。藍(lán)白斑篩選中，IPTG作為安慰性誘導(dǎo)物誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)的蛋白表達(dá)，X-gal作為生色底物。其原理為IPTG可誘導(dǎo)載體Lac操縱子DNA區(qū)段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，該片段可與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（α互補(bǔ)），實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)的細(xì)菌鋪在含有X-gal生色底物的培養(yǎng)基上，可形成藍(lán)色菌落；而外源DNA插入質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，可破壞α互補(bǔ)作用，培養(yǎng)基上將長(zhǎng)出白色菌落。IPTG也是常用的基因工程中重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑。

IPTG的誘導(dǎo)原理

（1）在原核蛋白表達(dá)體系中，如 E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、滲透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)控基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白（Lac阻遏物，不屬于乳糖操縱子），后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá) 。

（2）Lac 阻遏物是一種具有 4 個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。 在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，Lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，Lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘恰瓷砩系恼T導(dǎo)劑。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、RNA 聚合酶不再受阻礙，啟動(dòng)子P 開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)反應(yīng)開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

IPTG的優(yōu)點(diǎn)：

1.能誘導(dǎo)酶的合成，但又不被分解的分子，稱(chēng)為安慰誘導(dǎo)物。由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題，因此人們常用安慰誘導(dǎo)物來(lái)進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。

2.IPTG不被菌體代謝，為乳糖類(lèi)似物，一旦進(jìn)入細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生持續(xù)長(zhǎng)久的誘導(dǎo)效果，所以IPTG的誘導(dǎo)效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可達(dá)到理想誘導(dǎo)效果。由于IPTG不被代謝，在胞內(nèi)專(zhuān)一誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。不受細(xì)胞代謝的影響，誘導(dǎo)效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用，既能做為誘導(dǎo)劑異乳糖的前體物質(zhì)，又可以做碳源，在誘導(dǎo)過(guò)程中，很不穩(wěn)定，IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實(shí)驗(yàn)研究用。

3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。

4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點(diǎn)的親和力相同，IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識(shí)別，但它是lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。