一個孔中應(yīng)接種多少個細(xì)胞？
當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板進(jìn)行試驗？
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。
能否用24孔板進(jìn)行試驗？
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。
酚紅會影響檢測嗎？
不會。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性？
有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。
CCK-8能否檢測細(xì)菌細(xì)胞？
可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細(xì)胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。
CCK-8穩(wěn)定嗎？
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。
如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？
還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。
如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？
可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。
CCK-8是什么顏色？
應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。
CCK-8能否對活細(xì)胞進(jìn)行染色？
不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過電子載體PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對細(xì)胞進(jìn)行染色。
CCK-8檢測溶液對細(xì)胞是否有毒？
CCK-8溶液自身因為高濃度的PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK-8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK-8檢測后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細(xì)胞對于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細(xì)胞在加入CCK-8培養(yǎng)后的活力。
在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？
有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？
可能會有以下幾個原因： 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。 一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請預(yù)先在1,000-100,000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。
如何設(shè)定空白對照？
在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細(xì)胞毒性實驗)時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
哪些物質(zhì)會影響CCK8的測定？
當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK-8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。
在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？
可以縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間由2小時縮短為1小時。
設(shè)定參比波長的目的是什么？必須設(shè)定嗎？
不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。
說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑？
一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)？
有一下幾種方法（96孔板）： ①在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。②每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時之內(nèi)測定。
必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？
不一定。如果要向保持細(xì)胞的狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。
如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？
金屬對CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。
CCK-8試劑的保存條件？
在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。
預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計數(shù)嗎？
一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細(xì)胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進(jìn)行計數(shù)。
CCK-8對于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。
懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？
懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。
應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
有時在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細(xì)胞數(shù)量？
不能。由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細(xì)胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。
實驗之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應(yīng)？
需要，可用一個孔檢測一下，因為有培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實驗之前有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。
如果OD值太低，可以采取什么辦法？
可以采取2個辦法：① 適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量。② 延長加入CCK-8試劑后的染色時間。