產(chǎn)品名稱(chēng)：青枯雷爾氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒

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本產(chǎn)品是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的PCR試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品DNA模板。

2.引物等組分經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏度高。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他的DNA/RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線(xiàn)性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的染料法熒光定量PCR反應(yīng)。

青枯雷爾氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒操作方法

一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

1.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

2.如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。如果做定性分析，則6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品只選一個(gè)做（可以選4號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

【樣品要求】

1. 根據(jù)實(shí)際情況采樣，胃液分泌物、胃液嘔吐物以及樣品培養(yǎng)物作為檢測(cè)樣本，具體參考《臨床微生物樣本采集規(guī)范》。

2. 應(yīng)避免樣本間交叉污染，樣本采集后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，也可保存于-20±5℃待檢，長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70℃以下。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 12 個(gè)月。

青枯雷爾氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)方法的局限性

1樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

3 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

4 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

青枯雷爾氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒注意事項(xiàng)

1 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

2 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

3 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；

6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

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