中文名：T4 DNA連接酶

英文名：T4 DNA Ligase (Fast)

貨號：T397964

包裝：1kit

存儲溫度：-20°C儲存

產(chǎn)品介紹：

產(chǎn)品組成

注：1 U=1 Weiss unit

產(chǎn)品簡介

T4 DNA Ligase(Fast) 由攜帶 T4 噬菌體 gene 30 的大腸桿菌產(chǎn)生。 該酶催化雙螺旋 DNA 或 RNA 之間的 5'- 磷酸基團(tuán)和 3'- 羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈 DNA、RNA 或者 DNA/RNA 復(fù)合物間可修復(fù)單鏈缺刻 , 并且可以連接有粘性末端或者平末端的 DNA 片段，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物 DNA 片段克隆、基因定點(diǎn)突變與 PCR 產(chǎn)物克隆、修復(fù)雙鏈 DNA 缺刻與線性 DNA 自環(huán)化。T4 DNA Ligase(Fast) 需要 ATP 作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng)僅需 10 分鐘。

酶活單位定義

37℃條件下，1 Weiss unit 的酶在 20 min 內(nèi)催化 1 nmol 的 [32PPi] 轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài)。1 Weiss unit 等同于約 200 個粘性末端連接反應(yīng)單位（CEU），相當(dāng)于在 16℃條件下，30 min 內(nèi)連接 50% HindIII 消化后的 λDNA 片段。

酶活檢測條件

酶活在如下反應(yīng)混合物中進(jìn)行測試：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)，6.6 mM MgCl2，0.066 mM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]。

質(zhì)量控制

核酸內(nèi)切酶殘留測試：37℃條件下，將 200 U 的 T4 DNA Ligase(Fast) 與 1 μg 的 pUC19 DNA 中溫育 4 h，未檢測出由共價閉合環(huán)狀 DNA 轉(zhuǎn)變?yōu)閹в腥笨痰?DNA。

核酸外切酶殘留檢測：將酶液與雙鏈 DNA 底物在 37℃溫育 16 h，通過 DNA 電泳檢測雙鏈 DNA 底物無變化。

藍(lán)白斑測試：室溫條件下，使用 30 U T4 DNA Ligase 連接 pUC57 DNA/HindIII， pUC57 DNA/PstI 或 pUC57 DNA/SmaI 消化產(chǎn)物 1 h，然后用 E.coli XL1- Blue 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，檢測到少于 1% 的白斑。

使用方法

1. DNA 插入片段連接至載體 DNA（粘性末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 充分混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；

③ 取 1~5 μl 的連接產(chǎn)物用于 50 μl 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。

2. DNA 插入片段連接至載體 DNA（平末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

②充分混勻并瞬離，22℃溫育 1 h；

③ 取 1~5 μl 的連接產(chǎn)物用于 50 μl 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。

3. 線性 DNA 自環(huán)化

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；

③ 取 1~5 μl 的連接產(chǎn)物用于 50 μl 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。

4. 接頭連接 雙鏈寡核苷酸接頭經(jīng)常被用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。接頭通常包含限制酶識別位點(diǎn)，在連接后經(jīng)酶切處理產(chǎn)生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時無需在接頭連接完成后進(jìn)行插入片段的進(jìn)一步處理。

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；

③ 在 65℃作用 10 min 或者 70℃作用 5 min，進(jìn)行熱失活。

注：添加 1 mM ATP 的條件下，T4 DNA Ligase(Fast) 在 CutOne? 酶切緩沖液中具有 100% 的活力。因此，接頭連接反應(yīng)時可以在 CutOne? 酶切緩沖液中進(jìn)行， 以簡化“接頭連接 - 酶切”實(shí)驗(yàn)流程。具體方法為：接頭連接反應(yīng)完成后，先失活 T4 DNA Ligase，然后向該體系中添加 ATP 至終濃度 1 mM，再在體系中加入適量的 LightNing? 快速內(nèi)切酶，最后使用最適酶切反應(yīng)溫度進(jìn)行溫育即可。

注意事項(xiàng)

1. T4 DNA Ligase 在濃度高于 200 mM 的 NaCl 或 KCl 中會被強(qiáng)烈抑制；

2. 連接反應(yīng)液添加量不應(yīng)該超過感受態(tài)細(xì)胞體積的 10%，不推薦體系中加入過量的 T4 DNA Ligase；

3. 與 T4 DNA Ligase 結(jié)合的 DNA 可能會在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散，為了避免此現(xiàn)象，可以在上樣前對酶進(jìn)行熱失活，必要時加入適量的 SDS；

4. 聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG 8000 的推薦添加量是連接體系的 5%（w/v）；

5. 電轉(zhuǎn)化效率可能通過對 T4 DNA Ligase 熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化 DNA 方式來提高；

6. 轉(zhuǎn)化子數(shù)目可通過延長反應(yīng)時間至 1 h 而增加。

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