中文名：T4 DNA連接酶
英文名：T4 DNA Ligase (Fast)
貨號：T397964
包裝：1kit
存儲溫度：-20°C儲存
產品介紹：
產品組成
| 貨號 |
組分 |
規(guī)格 |
| T397964A-1000U |
T4 DNA Ligase (Fast) (5 U/μl) |
1000U |
| T397964B-1ml |
10×T4 DNA Ligase Buffer |
1ml |
| T397964C-1ml |
50% PEG |
1ml |
|
注：1 U=1 Weiss unit
產品簡介
T4 DNA Ligase(Fast) 由攜帶 T4 噬菌體 gene 30 的大腸桿菌產生。 該酶催化雙螺旋 DNA 或 RNA 之間的 5'- 磷酸基團和 3'- 羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈 DNA、RNA 或者 DNA/RNA 復合物間可修復單鏈缺刻 , 并且可以連接有粘性末端或者平末端的 DNA 片段，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內切酶酶切產物 DNA 片段克隆、基因定點突變與 PCR 產物克隆、修復雙鏈 DNA 缺刻與線性 DNA 自環(huán)化。T4 DNA Ligase(Fast) 需要 ATP 作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應僅需 10 分鐘。
酶活單位定義
37℃條件下，1 Weiss unit 的酶在 20 min 內催化 1 nmol 的 [32PPi] 轉變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài)。1 Weiss unit 等同于約 200 個粘性末端連接反應單位（CEU），相當于在 16℃條件下，30 min 內連接 50% HindIII 消化后的 λDNA 片段。
酶活檢測條件
酶活在如下反應混合物中進行測試：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)，6.6 mM MgCl2，0.066 mM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]。
質量控制
核酸內切酶殘留測試：37℃條件下，將 200 U 的 T4 DNA Ligase(Fast) 與 1 μg 的 pUC19 DNA 中溫育 4 h，未檢測出由共價閉合環(huán)狀 DNA 轉變?yōu)閹в腥笨痰?DNA。
核酸外切酶殘留檢測：將酶液與雙鏈 DNA 底物在 37℃溫育 16 h，通過 DNA 電泳檢測雙鏈 DNA 底物無變化。
藍白斑測試：室溫條件下，使用 30 U T4 DNA Ligase 連接 pUC57 DNA/HindIII， pUC57 DNA/PstI 或 pUC57 DNA/SmaI 消化產物 1 h，然后用 E.coli XL1- Blue 感受態(tài)細胞轉化連接產物，檢測到少于 1% 的白斑。
使用方法
1. DNA 插入片段連接至載體 DNA（粘性末端連接）
① 于冰上配制如下反應體系：
② 充分混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；
③ 取 1~5 μl 的連接產物用于 50 μl 化學感受態(tài)細胞的轉化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉感受態(tài)細胞的轉化。 注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。
2. DNA 插入片段連接至載體 DNA（平末端連接）
① 于冰上配制如下反應體系：
②充分混勻并瞬離，22℃溫育 1 h；
③ 取 1~5 μl 的連接產物用于 50 μl 化學感受態(tài)細胞的轉化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉感受態(tài)細胞的轉化。 注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。
3. 線性 DNA 自環(huán)化
① 于冰上配制如下反應體系：
② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；
③ 取 1~5 μl 的連接產物用于 50 μl 化學感受態(tài)細胞的轉化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉感受態(tài)細胞的轉化。 注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失活步驟。
4. 接頭連接 雙鏈寡核苷酸接頭經常被用于在插入片段上產生粘性末端。接頭通常包含限制酶識別位點，在連接后經酶切處理產生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時無需在接頭連接完成后進行插入片段的進一步處理。
① 于冰上配制如下反應體系：
② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育 10 min；
③ 在 65℃作用 10 min 或者 70℃作用 5 min，進行熱失活。
注：添加 1 mM ATP 的條件下，T4 DNA Ligase(Fast) 在 CutOne? 酶切緩沖液中具有 100% 的活力。因此，接頭連接反應時可以在 CutOne? 酶切緩沖液中進行， 以簡化“接頭連接 - 酶切”實驗流程。具體方法為：接頭連接反應完成后，先失活 T4 DNA Ligase，然后向該體系中添加 ATP 至終濃度 1 mM，再在體系中加入適量的 LightNing? 快速內切酶，最后使用最適酶切反應溫度進行溫育即可。
注意事項
1. T4 DNA Ligase 在濃度高于 200 mM 的 NaCl 或 KCl 中會被強烈抑制；
2. 連接反應液添加量不應該超過感受態(tài)細胞體積的 10%，不推薦體系中加入過量的 T4 DNA Ligase；
3. 與 T4 DNA Ligase 結合的 DNA 可能會在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散，為了避免此現(xiàn)象，可以在上樣前對酶進行熱失活，必要時加入適量的 SDS；
4. 聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG 8000 的推薦添加量是連接體系的 5%（w/v）；
5. 電轉化效率可能通過對 T4 DNA Ligase 熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化 DNA 方式來提高；
6. 轉化子數(shù)目可通過延長反應時間至 1 h 而增加。
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關鍵字： T4 DNA連接酶;T4 DNA Ligase (Fast)
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