中文名：Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒
英文名：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
貨號：A266226
包裝：100t、20t、50t
存儲溫度：2-8°C儲存,避光,干燥
產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品介紹
磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細胞膜外側(cè)，使PS暴露在細胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
將Annexin V進行綠色熒光（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖1.?細胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖
試劑盒組份
Reagents | 20 assays | 50 assays | 100 assays | Storage |
Annexin V-FITC | 100 μl | 250 μl | 500 μl | 4°C Protect from light |
Propidium Iodide, PI | 200 μl | 500 μl | 1000 μl | 4°C Protect from light |
Binding Buffer ( 4X ) | 4 ml | 10 ml | 20 ml | 4° |
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產(chǎn)品參數(shù)
Ex(nm)：490 ????Em(nm)：520
?所需實驗器材?
微量移液器；PBS；不含EDTA的胰酶消化液；低速離心機；流式細胞儀
注意事項?
1.??此試劑盒僅供研究使用。
2.??微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。
3.??Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
4.??Annexin V-FITC中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN3）,?操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
5. 本試劑盒用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數(shù)量不應(yīng)低于1x10^6。
6.??染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
7.??Annixin V檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測，可將胰酶消化后的細胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。
8.??消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，最終導(dǎo)致染色失敗。
9.??細胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
操作說明：
1. 細胞樣品的準備：
a) 懸浮細胞：
1）收集細胞?離?管中 1000-2000rpm 離? 5min，??去除上清。
2）? 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
3）再加? 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
b) 貼壁細胞：
1）吸出細胞培養(yǎng)液?離?管中，PBS 洗滌貼壁細胞?次，加?適量不含 EDTA 的胰酶細胞消化液消化細胞。
2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
3）加?以上步驟中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離?管內(nèi)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
注：加?的細胞培養(yǎng)液???可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)?凋亡或壞死的細胞，另???細胞培養(yǎng)液中的?清可以有效抑制或中
和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加?的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染?失敗。
4）? 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
5）再加? 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細胞，1000-2000rpm 離? 5min，??吸除上清。
2. ?去離??按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離??）；
3. 用 250μl 結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106
/ml；
4. 取 100μl 的細胞懸液于 5 ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25℃)避光孵育 10min；
6. 上機前 5min 加? 10μl 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機前在反應(yīng)管中補加 400μl PBS 重懸細胞， 避光保存，隨即進?流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC 為綠?熒光，PI 為紅?熒光。
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