Minerva Super Fusion Cloning Kit（無縫克隆試劑盒） 

產(chǎn)品貨號(hào)： M2026L 

產(chǎn)品規(guī)格：10 μL× 50T 

產(chǎn)品內(nèi)容：

注：微量體積試劑請(qǐng)?jiān)谡綄?shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行瞬時(shí)離心操作

儲(chǔ)存條件：-20℃保存，有效期見外包裝。

產(chǎn)品介紹：無縫克隆是一種簡(jiǎn)單、快速并且高效的 DNA 定向克隆技術(shù)，可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通過識(shí)別 DNA 片段和線 性化載體末端的 15-25 bp 同源序列，50℃反應(yīng) 15-60 min 即可將 DNA 片段和線性化載體高效精確地融合在一起， 完成定向克隆，且克隆陽性率可達(dá) 95%以上。 

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 簡(jiǎn)單、快速、高效，可將插入片段克隆至任意線性載體 的任意位點(diǎn)； 

2. 不依賴于連接酶，無載體自連，陽性率可達(dá) 95%以上； 

3. 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)； 

4. 一次反應(yīng)可完成單至多個(gè)片段重組。

使用方法：

流程概要圖：

一． 制備線性化克隆載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化，線性化載體 可以通過酶切或者反向 PCR 擴(kuò)增完成。 

（1）酶切制備 雙酶切：線性化完全，轉(zhuǎn)化背景（假陽性克?。┑?； 單酶切：線性化程度差，可通過適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間來減 少環(huán)狀質(zhì)粒的殘留。 注：（1）雙酶切無需去磷酸化，單酶切需要去磷酸化； （2）酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重 組反應(yīng)。 （2）反向 PCR 擴(kuò)增制備 載體質(zhì)粒 DNA 為模板，克隆位點(diǎn)為分界點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì) 反向引物，推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增。

二． 設(shè)計(jì)插入 PCR 引物片段 PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段（插入片段或 載體）末端同源的 15~25 nt（推薦 18 nt）序列。假如載體 為粘性末端，且 3’端突出，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分； 若 5’端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分，也可以不包含。 插入片段擴(kuò)增引物： 5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+基因特 異性正向擴(kuò)增序列—3’ 3’—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游 載體末端同源序列—5’

注：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆，當(dāng)載體克隆 位點(diǎn)上下游 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為 40~60%時(shí)，重組效率最高

三． 插入片段的 PCR 擴(kuò)增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 擴(kuò)增， 無需考慮產(chǎn)物末端有無 A 尾 (重組過程中將被去除， 在最 終質(zhì)粒中不會(huì)出現(xiàn))。 建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增以減 少擴(kuò)增突變的發(fā)生。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫 克隆反應(yīng)，若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò) 增產(chǎn)物，可直接可用于無縫克隆反應(yīng)，但加樣的體積不宜超 過反應(yīng)總體積的 20% 。

四．無縫克隆反應(yīng)：

1. 冰水浴中配制以下反應(yīng)體系：

1.最適載體用量（ng）= 0.02×載體堿基對(duì)數(shù)，即 0.03 pmol。 2 插入單片段時(shí)，最適片段用量（ng）= 0.04×片段堿基對(duì)數(shù)；插入多 片段時(shí)，每片段最適用量（ng）= 0.02×片段堿基對(duì)數(shù)。 注：（1）如果插入的單片段長(zhǎng)度大于載體，那么應(yīng)互換載體與插入片段 用量； （2）如果插入的片段長(zhǎng)度小于 200 bp，那么要使用 5 倍載體的用量； （3）如果按上述公式計(jì)算得到的用量低于最低/高于最高值，那么建議 直接按最低/最高用量使用； （4）載體或插入片段過長(zhǎng)，片段數(shù)量過多，均會(huì)降低陽性率。 體系配制完成后，輕輕吹吸數(shù)次混勻各組分，避免產(chǎn)生 氣泡即可，切勿渦旋。

2. 將反應(yīng)體系置于 50℃，反應(yīng) 15-60 min。 注：（1）推薦使用溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng)，如 PCR 儀，反應(yīng)時(shí) 間不足或過長(zhǎng)都會(huì)降低克隆效率； （2）當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上時(shí)，建議延長(zhǎng)反 應(yīng)時(shí)間到 30~60 min； （3）50℃反應(yīng)完成后，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心，將反應(yīng)液收集至管底。 3. 將反應(yīng)液離心管置于冰水浴中冷卻，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化或儲(chǔ) 存于-20℃。 注：-20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內(nèi)使用。 

五． 克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 在 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入 5-10 μL 反應(yīng)液，輕柔吹 吸混勻，置于冰上 30 min。42℃熱激 45~60s，冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng) 40-60 min （200 rpm）。將菌液均勻涂布在含相應(yīng)抗生素的平板上，倒 置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。 注：（1）不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽性率會(huì)有所差別，推 薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 cfu/μg 的感受態(tài)細(xì)胞； （2）PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度決定了菌落數(shù)； （3）陽性對(duì)照平板通常生長(zhǎng)大量白色單菌落，陰性對(duì)照平 板只生長(zhǎng)很少的菌落。 

六． 陽性克隆檢測(cè)菌落 PCR 鑒定：挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻， 95℃裂解 10 min，取 1 μL 作模板，進(jìn)行菌落 PCR 鑒定，推薦使用 UE 2×Taq PCR Master Mix（Green）（S2045）。 酶切鑒定：將單菌落接種到抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提 取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

注意：（1）建議菌落 PCR 時(shí)，至少使用一條通用引物，可有效避免假 陽性結(jié)果； （2）必要時(shí)可進(jìn)一步對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序鑒定

常見問題