人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基（無酚紅）

一、產(chǎn)品基本信息

二、產(chǎn)品簡介

人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell^?）自主研發(fā)的一款無外源動物成分的人脂肪干細胞培養(yǎng)基。可應(yīng)用于人脂肪組織來源的人脂肪干細胞的擴增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠低于中國藥典標準，生產(chǎn)過程遵循ISO9001體系,并符合GMP指導原則。

人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素，細胞因子等。

三、產(chǎn)品特性

l 無外源動物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險。

l 全程無血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。

l 培養(yǎng)過程無需包被培養(yǎng)板。

l 擴增效率高，24h左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時間。

l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠低于中國藥典水平。

 四、產(chǎn)品內(nèi)容

五、相關(guān)產(chǎn)品

無血清細胞凍存液（治療級）（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001006）

人臍帶間充質(zhì)干細胞（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001003）

人脂肪間充質(zhì)干細胞（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001004）

細胞消化液（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001024 ）

六、實驗準備

人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基配制

1. 37℃快速解凍人脂肪干細胞無血清添加劑，快速溶解時不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃，避免反復凍融 。

2. 將添加劑以10%比例加入到人脂肪干細胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，即為人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001042PRF）?；旌虾笈囵B(yǎng)基可在2-8℃ 穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用已配制超過3周的培養(yǎng)基。

3. 人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基可直接應(yīng)用于人脂肪組織來源的脂肪干細胞擴增與傳代培養(yǎng)。

七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作)

人脂肪干細胞的分離方法

1. 清洗脂肪組織提取物

新鮮脂肪組織放入4℃預冷的臍帶脂肪保存液（AC-1001016）中，并快速運輸?shù)綄嶒炇疫M行細胞分離，充分的清洗脂肪組織提取物，去掉大部分紅細胞和淋巴細胞。

1.1. 將約10-20mL的脂肪組織提取物放到一個無菌50mL離心管中;

1.2. 靜置一段時間直到脂肪組織與血液分層；

1.3. 用一個巴氏吸管移走血液；

1.4. 加入相同的體積的含有雙抗的PBS，蓋緊蓋子；

1.5. 劇烈搖晃5-10S

1.6. 將50mL離心管放到臺面上使脂肪組織飄在PBS上面。根據(jù)樣品的不同，這大概需要1-5min。

1.7. 用一個巴氏吸管小心的去除PBS；

1.8. 重復以上的清洗步驟3次（步驟3.4-3.7）

1.9. 最后一次的清洗液體應(yīng)是清澈的。如果液體仍是紅色的，重復步驟3.4-3.7再次清洗。 

2. 脂肪組織消化

用人脂肪干細胞分離液（AC-1001013）處理脂肪組織

2.1. 在處理開始前10min,37℃預熱人類脂肪干細胞分離液；

2.2. 加入與清洗過的脂肪組織等體積的人類脂肪干細胞分離液至50mL離心管；

2.3. 劇烈旋轉(zhuǎn)搖動50mL離心管5-10s

2.4. 放到37℃培養(yǎng)箱中搖動孵育1-2h，每15min人工劇烈搖晃5-10s

2.5. 處理結(jié)束后，處理后的脂肪組織應(yīng)呈現(xiàn)粥樣的形態(tài)，(如果消化1h后消化效果不完全，

延長消化時間到2h，具體根據(jù)消化程度確定）。

3. 分離基質(zhì)血管部分

3.1. 將人脂肪干細胞分離液處理后的脂肪組織室溫200g離心5min，脂肪組織出現(xiàn)分層，參考圖1。

3.2. 用巴氏吸管吸掉上層漂浮的脂肪層和中間液體層。留5mL底部液體,將SVF團留在管底(吸液時要注意，細胞團是凝膠狀的，貼附不牢，容易被吸掉)。

3.3. 用10mL 人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001042PRF）重懸細胞團；

3.4. 室溫300 ×g離心5min；

3.5. 去掉上清，留5mL底部的基質(zhì)細胞和人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基混合液；

3.6. 重復3.3-3.5步驟；

3.7. 室溫300 ×g 離心5min；

4. 重懸SVF，接種

4.1. 用4mL 人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基重懸新鮮分離的細胞，并計數(shù)；

4.2. 將細胞接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，接種的細胞密度為1×10 個，可接種到1個T25的培養(yǎng)瓶中或6孔板的2個孔中，輕輕搖動使細胞平均分布到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿表面，置于37℃，5% CO 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4.3. 接種24h后，換液去除未貼壁的細胞；

4.4. 每天在顯微鏡下觀察細胞；

4.5. 細胞通常需要3-5天變成纖維狀細胞，并開始分裂；

4.6. 每2天換液，細胞通常在培養(yǎng)5-7天后達到80-90%匯合度；可以傳代或凍存，此時的細胞為P0代；

5. 脂肪間充質(zhì)干細胞傳代

培養(yǎng)5-7天后細胞達到80-90%匯合度時（參考圖2），可以予以傳代或凍存。

5.1. 吸掉培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入適量細胞消化液（AC-1001024）覆蓋皿底，37℃孵育2-3min，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，停止消化。輕輕敲打皿邊待細胞呈細沙狀脫落時迅速加入2倍體積的人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集到15mL離心管中。

注意：吹打時不能有氣泡

5.2. 室溫300×g 離心5min；

5.3. 棄上清，加入人類間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，按照1:3-1:6的比例傳代。也可以計數(shù)，接種密度為；

5.4. 2-3×10 /cm 。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO 條件下培養(yǎng)。

       6. 加入與清洗過的脂肪組織等體積的人類脂肪干細胞分離液

hASC細胞傳代培養(yǎng)

1. 在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到90%，即可傳代。

2. 在超凈臺/安全柜中，吸掉原有培養(yǎng)基，加入PBS溶液清洗一次，加入細胞消化液（AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底。

3. 室溫孵育4-5分鐘或37℃孵育2-4分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。

4. 加入消化液2倍體積的人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。

5. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1200rpm離心3 min。

6. 棄上清，加入人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，重懸細胞，計數(shù)。1：3-1：4比例傳代，或按1-2x104 cells/cm2  傳代，均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意：細胞傳代所需的時間：2-4天。5代及之前的細胞，生長速度較快。5代以后的細胞，生長速度稍緩。

hASC細胞凍存

1. 細胞達到90%匯合度， 吸掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗一次。

2. 加入細胞消化液（AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底，室溫孵育4-5min或37℃孵育2-4min分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。

3. 加入消化液2倍體積的人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。

4. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1200 rpm離心3 min，吸掉上清。

5. 加入適量無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006），調(diào)整細胞凍存密度在1×106 cells/mL左右，每支凍存管分裝1.5-2ml。

6. 直接放入-80℃，24h后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。

細胞形態(tài)圖

八、質(zhì)量控制