人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基（無酚紅）
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱 | Applied Cell ? 人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基 |
貨 號 | AC-1001043（PRF） |
規(guī) 格 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基450mL，添加劑50mL |
運輸保存條件 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基2-8℃，添加劑-20℃至-80℃；混合后2-8℃ |
使用范圍 | 人臍帶來源的干細胞原代分離、擴增與傳代培養(yǎng) |
保質(zhì)期 | 12個月 |
二、產(chǎn)品簡介
人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基是埃澤思生物（Applied Cell?）自主研發(fā)的一款無外源動物成分的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基?？蓱糜谌四殠ЫM織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養(yǎng)，并保持其多向分化潛能。本產(chǎn)品內(nèi)毒素水平遠低于中國藥典標準，生產(chǎn)過程遵循ISO9001體系,并符合GMP指導原則。
人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基主要成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素，細胞因子等。
三、產(chǎn)品特性
l 無外源動物蛋白成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險。
l 全程無血清生產(chǎn)，極大降低批次間差異。
l 可用于原代分離，且培養(yǎng)過程無需包被培養(yǎng)板。
l 擴增效率高，24h左右增殖翻倍，節(jié)省培養(yǎng)時間。
l 內(nèi)毒素<0.06EU/ml，遠低于中國藥典水平
四、產(chǎn)品內(nèi)容
組分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 運輸 |
人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 450mL | 1瓶 | 冰袋 |
人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清添加劑 | 50mL | 1瓶 | 干冰 |
五、相關(guān)產(chǎn)品
無血清細胞凍存液（治療級）（Applied Cell?: Cat. no.AC-1001006）
人臍帶間充質(zhì)干細胞（Applied Cell?: Cat. no.AC-2001003） 細胞消化液（Applied Cell?: Cat. no. AC-1001024）
六、實驗準備
人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基配制
1. 37℃快速解凍人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清添加劑，快速溶解時不易破壞添加劑中營養(yǎng)物質(zhì)，時間大致為10min。待添加劑融化后搖勻，分裝或直接按比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝后添加劑立即儲存于-20℃至-80℃，避免反復凍融 。
2. 將添加劑以10%比例加入到人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，即為人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基（AC-1001043PRF）。混合后培養(yǎng)基可在2-8℃ 穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用已配制超過3周的培養(yǎng)基。
3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基可直接應用于人類臍帶組織來源的干細胞的原代分離、擴增與傳代培養(yǎng)。
4. 預先高溫高壓滅菌處理剪刀，鑷子等實驗器械。
5. 預先紫外滅菌超凈臺/安全柜等實驗環(huán)境。
七、操作方法(以下步驟皆應在無菌條件下操作)
1. 人臍帶間充質(zhì)干細胞原代分離（貼壁法）
臍帶簡介：臍帶包括臍帶血、華通氏膠、兩根動脈、一根靜脈，所有這些結(jié)構(gòu)被臍帶上皮（內(nèi)襯膜）包裹。臍帶是間充質(zhì)干細胞的主要來源，其中華通氏膠只含有間充質(zhì)干細胞一種干細胞，是最常用來分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的結(jié)構(gòu)。而內(nèi)襯膜則含有至少兩種干細胞：間充質(zhì)干細胞和上皮干細胞，這兩種干細胞也是細胞治療的主要來源。
以下方法為從華通氏膠中分離高純度的間充質(zhì)干細胞詳細步驟：
1.1. 無菌收集長度約10cm的臍帶，迅速將臍帶放到含有人臍帶脂肪保存液（AC-1001016）的50mL離心管中。在4℃條件下快速運到實驗室，在4h內(nèi)處理完成全部過程。
1.2. 將臍帶置于生物安全柜中冰盒里放置的直徑10cm培養(yǎng)皿中。用預冷的PBS多次清洗臍帶，去除殘留的血液即止。以下分離組織塊的過程確保全程臍帶浸泡在預冷PBS中保持濕潤。
1.3. 使用剪刀徑向剖開臍帶，將血管以及周圍的華通氏膠暴露出來。
1.4. 用解剖刀將華通氏膠與血管分離，用鑷子夾住血管，整條剝離，中間白色部分即華通氏膠（具體人類臍帶結(jié)構(gòu)參見圖1） 。
1.5. 用剪刀將華通氏膠剪成0.5-1cm見方的薄片組織塊，盡量不要太厚。最后剩余的臍帶上皮（內(nèi)襯膜）組織 棄除。
注意：組織塊盡量接近片狀，增大與培養(yǎng)皿接觸面積，提高細胞爬出率
1.6. 每個直徑10cm的培養(yǎng)皿中放置10-15個組織塊，加入6mL 完全培養(yǎng)基。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 不同原代分離體系初始組織塊數(shù)量以及細胞爬出率見表1。
注意：①為促進組織塊貼壁，培養(yǎng)基不能加太多，否則組織塊容易漂起
②為促進組織塊貼壁，72小時內(nèi)不能搖晃培養(yǎng)皿，72小時次換液也是同理。
培養(yǎng)們直徑 | 初始組織塊數(shù)量 | 細胞爬出組織塊數(shù)量 | 細胞爬出率 |
10cm | 16.9 | 11.8 | 69.8% |
表1 臍帶組織塊粘壁數(shù)據(jù)（平均數(shù)據(jù)）
1.7. 每72小時換液。一般5-7天可以看見貼壁組織塊附近有細胞爬出，12-15天細胞匯合度達到70%以上，即可準備傳代。
1.8. 細胞傳代時，用槍頭吸掉組織塊以及原有培養(yǎng)基，加入5mlPBS清洗一次。每個直徑10ml，的培養(yǎng)皿中加入5ml的細胞消化液（AC-1001024 ），搖勻覆蓋皿底，37℃恒溫箱2-3min或室溫3-5min孵育。
1.9. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿底，輕輕敲打皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入同體積完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞完全脫落下來，將細胞懸液收集到15mL離心管中，300×g離心5min。
1.10. 用完全培養(yǎng)基重懸、計數(shù)，此時的細胞稱為P0代。相關(guān)代次預期收獲細胞量請參考表2。
1.11. 根據(jù)本公司統(tǒng)計數(shù)據(jù)，10cm長的臍帶，約可以收獲1.24×107個P0代細胞，一根臍帶長度 大約20cm，約可以收獲2.5×107個P0代細胞。
1.12. 根據(jù)本公司檢測，按1:8傳代，細胞形態(tài)在P10代內(nèi)不發(fā)生變化。P10代以上細胞沒有實際應用意義，暫不檢測。
1.13. 臍帶兩端的組織原代分離效率有較大差異，近胎盤端分離效率要高于近胎兒端10-30%。
| P0 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
細胞數(shù)量 | 1.2×107 | 9.6×107 | 7.7×108 | 6.2×109 | 5.0×1010 | 4.0×1011 |
表2 10cm長的臍帶P0-P5代預計收獲細胞數(shù)量（1:8傳代）
2. 人臍帶間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)
2.1. 在顯微鏡下觀察細胞，細胞匯合度達到90%，即可準備傳代;
2.2. 吸掉培養(yǎng)瓶/皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入適量的細胞消化液（AC-1001024）覆蓋瓶/皿底，37℃恒溫箱2-3min或室溫3-5min孵育。
2.3. 顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離瓶/皿底，輕輕敲打瓶/皿底，細胞呈細沙狀脫落，加入等倍體積的完全培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打使細胞脫落下來，并輕輕吹打成單細胞，將細胞懸液收集到適當?shù)碾x心管中，室溫300×g 離心5min。
2.4. 棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，重懸細胞，按照比例進行傳代或計數(shù)后按照1.1-1.45×104個/cm2密度進行接種。均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng)。相關(guān)數(shù)據(jù)請見表3。
注意：細胞規(guī)模生產(chǎn)建議1:5-1:8傳代，一般72小時可以達到90%以上匯合度。
| 清洗PBS體積 | 消化液體積 | 培養(yǎng)基體積 | 接種細胞數(shù)量 |
10cm dish | 5ml | 5ml | 10ml | 6.0-8.0×105 |
T25培養(yǎng)瓶 | 3ml | 3ml | 5ml | 2.7-3.7×105 |
T75培養(yǎng)瓶 | 8ml | 8ml | 15ml | 0.8-1.1×106 |
T175培養(yǎng)瓶 | 18ml | 18ml | 35ml | 2.0-3.0×106 |
表3 不同體系建議細胞接種數(shù)量及加液量
3. 人臍帶間充質(zhì)干細胞凍存
3.1. 同步驟2.1；
3.2. 同步驟2.2；
3.3. 同步驟2.3；
3.4. 棄上清，用4℃保存的無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）重懸細胞，取部分細胞計數(shù)。
注意：無血清細胞凍存液即拿即用，用完之后盡快放回4℃冰箱，以防室溫放置太久，影響質(zhì)量。
3.5. 計數(shù)后用無血清細胞凍存液（治療級）（AC-1001006）調(diào)節(jié)細胞密度至建議凍存密度1-5×106個/mL，每支凍存管（需提前做好標記）分裝1.5-2mL，直接放入-80℃冰箱快速凍存。
3.6. -80℃放置過夜后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。
4. 人臍帶間充質(zhì)干細胞復蘇
4.1. 從液氮中取出凍存的hUMSC，37℃水浴快速融解。
4.2. 在生物安全柜或超凈臺中，先在15mL離心管中加入5 mL 37℃預熱的完全培養(yǎng)基，將解凍后的細胞懸液緩慢滴加到離心管中。
4.3. 300×g離心3min，吸掉上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞至建議接種濃度（參考表3）。
4.4. 將細胞懸液均勻滴加到培養(yǎng)瓶/皿中，水平十字振動培養(yǎng)瓶/皿使細胞均勻。置于37℃，5% CO2 條件下培養(yǎng)24小時后觀察細胞復蘇狀態(tài)。
4.5. 細胞無異常即可同時更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
4.6. 初次換液后每 48-72小時更換培養(yǎng)液直至傳代。
八、人臍帶間充質(zhì)干細胞模式圖
九、人臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖以及分化檢測
十、人臍帶間充質(zhì)干細胞流式檢測
十一、質(zhì)量控制
檢驗項目 Test Catagories | 參考數(shù)據(jù) Reference Data |
外觀 Physical APPearance | 無色液體 Colorless liquid |
澄清度 Clarity | 澄清 Clear |
pH值 Ph Value | 7.0-7.4 |
滲透壓 Osmolality | 270-340 （mosm/KgH2O） |
細菌內(nèi)毒素 Endotoxin | 小于0.06 EU/ml |
無菌 Sterility | 無菌 Sterility |
支原體 Mycoplasma | 0.11um過濾，支原體試驗為陰性 The mycoplasma test was negative after 0.11um filtration |
細胞生長試驗 Cell growth test | 細胞為梭形，呈指紋狀或螺旋狀生長 The cells are spindle - shaped, fingerlike or spiral |
關(guān)鍵字： 干細胞培養(yǎng)基;間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基;人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基;人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基（無酚紅）;
埃澤思生物總部位于上海，公司取名Applied Cell(應用細胞)，是一家致力于為細胞治aize 療、再生埃澤思生物總部位于上海，公司取名AppliedCell(應用細胞)，是一家致力于為細胞治療、再生醫(yī)學提供核心原料，以及研發(fā)服務(wù)（CRO ）和生物藥委托開發(fā)生產(chǎn)服務(wù)（CDMO）的生物科技公司。目前公司產(chǎn)品已經(jīng)涵蓋干細胞、免疫細胞治療全流程試劑原料。其中核心產(chǎn)品已經(jīng)完成美國FDADMF備案以及國家藥品評審中心（CDE）藥物原輔料備案，是國內(nèi)資質(zhì)最為齊全的細胞治療原料供應商之一。目前，公司已與國內(nèi)6家細胞治療企業(yè)進行細胞治療一類新藥聯(lián)合申報，一項日本一類新藥聯(lián)合申報。