產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來(lái)源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合，通常用來(lái)標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞體系中的F-actin，從而對(duì)F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無(wú)論是動(dòng)植物來(lái)源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

本品為iFluor 350標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽,可發(fā)出高亮度、穩(wěn)定的一種亮紅色熒光染料,染色反應(yīng)特異性強(qiáng),對(duì)比性高,適合用作F-actin的定性和定量檢測(cè)。與Actin抗體比較,iFluor 350鬼筆環(huán)肽具有如下優(yōu)點(diǎn):1)與actin亞單位一比一結(jié)合,并且不與G-actin結(jié)合,具有比Actin抗體更好的染色效果;2)且本品的結(jié)合沒(méi)有物種差異性,適用性廣泛;3)鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的非特異性信號(hào)可忽略,因而圖像的反差較好;4)染色與用于細(xì)胞分析的其他熒光染色完全兼容,包括熒光蛋白、Qdot 納米晶體和其他iFluor偶聯(lián)物(包含iFluor偶聯(lián)二抗);5)經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。

操作步驟

1.母液及工作液配制 

母液準(zhǔn)備：對(duì)于iFluor 350標(biāo)記鬼筆環(huán)肽。本品以凍干粉形式提供，冰箱取出后先進(jìn)行回溫，300T規(guī)格加入300ul的1×PBS緩沖液,即可得到300ul存儲(chǔ)母液，建議根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。4℃避光保存，3個(gè)月穩(wěn)定。

工作液準(zhǔn)備：開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：1:40～1:200。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。按照1：200比例來(lái)計(jì)算，即1ul體積的iFluor 350標(biāo)記鬼筆環(huán)肽溶液中加入200ul的1×PBS緩沖液濃度，可進(jìn)行300次細(xì)胞染色。【注】：稀釋比可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果適當(dāng)調(diào)整。

2.  染色步驟

1：細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

2：吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3：使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。 【注意】：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

4：室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

5：室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6：室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

7：取200μl配制好的iFluor 350標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。 注意：為了降低背景，可于iFluor 350標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過(guò)程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

8：用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9：使用200μl DAPI溶液（濃度：100 nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

10： 用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

11： 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇iFluor 350激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=347/448 nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項(xiàng)

1）鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對(duì)人的半數(shù)致死劑量LD50約2mg/kg）。

2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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