試劑盒內(nèi)容

產(chǎn)品說明：

        本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的 DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。

       使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA(將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入)，混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

操作步驟（僅供參考）：

1、取5 mL 細(xì)菌培養(yǎng)物，12000 rpm離心1 min，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個2 mL 離心管中)。

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入  250 μL  溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNaseA)，使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意:如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3、向離心管中加入250 μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意:混勻一定要溫和以免污染細(xì)菌基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。

4、向離心管中加入350 μL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮沉淀。12000 rpm離心10 min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意:溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，空溫放置2 min，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500 μL漂洗液Ⅰ(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入700 μL漂洗液Ⅱ(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8、向吸附柱中加入700 μL漂洗液Ⅱ，12000 rpm 離心1 min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9、12000 rpm離心2 min，將吸附柱敞口置于室溫或50 ℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。

10、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200 μL經(jīng)65℃水浴熱的洗脫液，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。

11、為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。

注意事項：

1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、漂洗液Ⅰ和漂洗液Ⅱ使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100μL，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。

3、DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD₂₆₀處有顯著吸收峰，OD₂₆₀值為1相當(dāng)于大約50ug/mL雙鏈DNA、40ug/mL單鏈DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。