內切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒說明書

                                      分光光度法50管/24樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

內切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒測定意義：

Cx（EC3.2.1.4）存在于細菌、真菌和動物體內，是纖維素酶系的組份之一，Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚體。

測定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測定Cx催化羧甲基纖維素鈉降解產生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體60mL×1瓶，4℃保存；

樣品測定的準備： 

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

內切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。

2、加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃準確水浴2h

混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，測540nm下吸光值A，計算ΔA=A測定管

-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

Cx活性計算：

1、標準條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）Cx活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、細胞、細菌和組織中Cx活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

Cx活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應體系總體積，0.55mL； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。