硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50管/48樣
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)試劑盒測(cè)定意義:
TrxR是一種NADPH依賴(lài)的包含FAD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶,屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員,與硫氧還蛋白以及NADPH共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR與GR活性類(lèi)似,催化GSSG還原生成GSH,是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。
測(cè)定原理:
TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412 nm有特征吸收峰,通過(guò)測(cè)定412nm波長(zhǎng)處TNB的增加速率,即可計(jì)算TrxR活性。
自備儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體90mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體5mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入5 mL蒸餾水溶解。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
TrxR測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm,用蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一在25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動(dòng)物)預(yù)熱30min。
3. 測(cè)定管:取1mL玻璃比色皿,加入100μL試劑二,100μL試劑三,700μL試劑一,100μL上清液,迅速混勻后于412 nm測(cè)定10 s和310 s吸光度,記為A3和A4。△A測(cè)定管=A2-A1。
TrxR活性計(jì)算公式:
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。
TrxR(nmol/min /mg prot)=△A測(cè)定管÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
= 147×△A測(cè)定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。
TrxR(nmol/min /g鮮重)=△A測(cè)定管÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 147×△A測(cè)定管÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。
TrxR(nmol/min/104 cell)=△A測(cè)定管÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 147×△A測(cè)定管÷ 細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個(gè)酶活單位。
TrxR(nmol/min /mL)=△A測(cè)定管÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
= 147×△A測(cè)定管
ε:TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù),0.0136 L/μ mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積(L),1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),100μL=0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間(min),5 min。
硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)試劑盒注意事項(xiàng):
1. 測(cè)定前須先取1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),哺乳動(dòng)物組織及血液制品TrxR活力測(cè)定時(shí),一般須用蒸餾水稀釋5倍左右;測(cè)定過(guò)程操作須迅速。
2. 試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完。
關(guān)鍵字: 硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredox;硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredox;
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