硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)活性測定試劑盒說明書
分光光度法 50管/48樣
注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
TPX屬于過氧化物酶家族,在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi),如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌,在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。
硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)活性測定試劑盒測定原理:
TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2的吸收波長為240nm,通過測定240nm吸光度的下降速率,即可計算出TPX活性。
自備儀器和用品:
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體50mL×1瓶,室溫保存。
試劑二:液體50mL×1瓶,- 20℃保存。
試劑三:液體5mL×1瓶,4℃。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
TPX測定操作:
1. 分光光度計預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到240 nm,蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴預(yù)熱30 min。
3.取1mL石英比色皿,加入20 μ L上清液,900 μ L試劑二,80 μ L試劑三,迅速混勻后于240 nm測定10 s和130 s吸光度,記為A1和A2。
TPX活性計算公式:
(1) 按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=573×(A1-A2)÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/g鮮重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1-A2)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1-A2)÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=573×(A1-A2)
ε:H2O2的摩爾消光系數(shù),43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積(L),1000 μ L=0.001 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20 μ L=0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W,
關(guān)鍵字: 硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredox;硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredox;
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