硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（thioredoxin peroxidase, TPX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50管/48樣
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
TPX屬于過(guò)氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過(guò)還原過(guò)氧化氫和一些氫過(guò)氧化物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類(lèi)似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。
硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（thioredoxin peroxidase, TPX）活性測(cè)定試劑盒測(cè)定原理：
TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2的吸收波長(zhǎng)為240nm，通過(guò)測(cè)定240nm吸光度的下降速率，即可計(jì)算出TPX活性。
自備儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一：液體50mL×1瓶，室溫保存。
試劑二：液體50mL×1瓶，- 20℃保存。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
TPX測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到240 nm，蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴預(yù)熱30 min。
3.取1mL石英比色皿，加入20 μ L上清液，900 μ L試劑二，80 μ L試劑三，迅速混勻后于240 nm測(cè)定10 s和130 s吸光度，記為A1和A2。
TPX活性計(jì)算公式：
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。
TPX活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
=573×(A1－A2)÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。
TPX活性（nmol/min/g鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1－A2)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。
TPX活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。
TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=573×(A1－A2)
ε：H2O2的摩爾消光系數(shù)，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000 μ L=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20 μ L=0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，
關(guān)鍵字： 硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（thioredox;硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（thioredox;
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