谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）說明書
分光光度法50管/48樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）測定意義：
GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護生物膜免受ROS的損害，維持細胞的正常功能；而且具有保護肝臟、提高機體免疫力、拮抗有害金屬離子對機體的傷害和增加機體抗輻射等能力。
測定原理：
GSH-Px催化有機過氧化物氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340 nm光吸收減少速率來計算GSH-Px活性。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：液體100mL×1瓶，室溫保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體20μL×1支，-20℃保存。
試劑四：液體200μL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）測定操作：
1. 分光光度計預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min。
3. 混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一40 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，混勻。（注意：必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當天使用完）
4.試劑四的稀釋： 吸取21.5μL試劑四，加入5mL水充分混勻，臨用前配制，配制好的試劑當天使用。
5. 測定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、800μL預熱的混合試劑、100μL稀釋后的試劑四， 迅速混勻后于340nm處測定第30 s和第210s的吸光值，分別記為A1和A2，△A= A1﹣A2。
計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
GSH-Px活力單位定義：一定溫度中，每mg蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷（Cpr×V樣）÷T
=536×△A÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
GSH-Px活力單位定義：一定溫度中，每g樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=536×△A÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：一定溫度中，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A÷ε÷d×V反總×109]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=536×△A÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×109]÷V樣÷T
=536×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；V反總：反應體系總體積，1000μL=0.001 L；106：1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入反應體系中上清液體積，100μL =0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，3 min。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；
（2）混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當天使用完；
（3）測定過程操作須迅速；
（4）細胞中GSH-Px活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GSH-Px的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。
關鍵字： 谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion;谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion;
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