細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物研究領(lǐng)域內(nèi)是必不可少的核心環(huán)節(jié).在培養(yǎng)過程中面臨的一個嚴(yán)重問題就是細(xì)胞污染其中支原體是最主要的污染源。支原體在光學(xué)顯微鏡下不可見而且被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基在一般情況下往往并不渾濁,細(xì)胞受損程度也不明顯,形態(tài)很少改變,因此細(xì)胞被支原體污染后很難察覺。細(xì)胞一旦被支原體污染后.支原體會消耗細(xì)胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì).代謝產(chǎn)物不斷積累.會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中pH值的改變誘導(dǎo)或抑制某些細(xì)胞因子的表達(dá).會影響培養(yǎng)細(xì)胞的代謝和增殖特征。

在日常工作環(huán)境中支原體可以說無處不在.它可以通過人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動物的皮毛以及日常的細(xì)胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對細(xì)胞的污染。能夠造成細(xì)胞污染的支原體種類有很多,有些細(xì)胞其至同時感染2種以上的支原體。由干支原體體積很小.直徑約在0.2-2.0pm之間.可以通過濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上支原體形態(tài)多變.多吸附在細(xì)胞表面或分散于細(xì)胞與細(xì)胞之間,是一類沒有細(xì)胞壁的微生物.因此對作用于細(xì)胞壁類的抗生素(如青霉素)不敏感常用的檢測方法有培養(yǎng)法、熒光染色法、PCR法和電鏡觀察法。培養(yǎng)法是最為可靠目成本低廉的方法.但培養(yǎng)周期較長.常用于細(xì)胞以及臨床治療細(xì)胞的支原體檢查熒光染色法是用特異熒光染料(Hoechst 33258)染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測,熒光染料(Hoechst33258)是一種能和DNA特異結(jié)合物質(zhì).如果檢測樣品為支原體污染 則附在細(xì)胞表面和分散在細(xì)胞與細(xì)胞之間的支原體DNA著色 在熒光顯微鏡下可見PCR法檢測是通過對支原體特定的序列設(shè)計引物 當(dāng)存在支原體污染時通過PCR特異性擴(kuò)增.會將目標(biāo) DNA特異性的復(fù)制,然后通過瓊脂糖電泳觀檢測.會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果,反之當(dāng)沒有支原體污染時,由于沒有模板.PCR無法擴(kuò)增.則瓊脂糖電泳跑不出條帶.出現(xiàn)陰性結(jié)果:電鏡觀察法是利用電子顯微鏡的超級放大功能直接觀察培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染情況。

在此主要介紹利用熒光染色法來檢測培養(yǎng)細(xì)胞中的支原體,具體檢測步驟如下:

(1)細(xì)胞爬片培養(yǎng):待測細(xì)胞培養(yǎng)至傳代水平.將細(xì)胞消化后接種至含有玻片的細(xì)胞板中,培養(yǎng)至60%-70%匯合時.進(jìn)行檢測

(2)漂洗·將細(xì)胞板中的培養(yǎng)液吸出 取出玻片用PBS輕輕漂洗

(3)固定:加入適量的固定液.室溫放置10min

(4)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次

(5)染色:加入適量的熒光染料(Hoechst 33258)工作液,在室溫下放置10min

(6)漂洗:用PBS輕輕漂洗3次:

(7)鏡下觀察:將玻片晾干后.滴加抗熒光猝滅劑,于熒光顯微鏡下觀察、拍照

(8)實驗結(jié)果如圖所示: