細胞凋亡檢測中 Annexin V 與 7 - 氨基放線菌素（7 - amino - actinomycin D，7 - AAD）或碘化丙啶（Propidium iodide，PI）雙染法的原理

在正常狀態(tài)下，活細胞的細胞膜完整無損，其中的磷脂酰絲氨酸（PS）作為細胞膜的一個組分，處于細胞膜的內(nèi)側(cè)。而一旦細胞啟動凋亡進程，細胞膜的結(jié)構(gòu)隨即發(fā)生變化，致使原本位于內(nèi)側(cè)的 PS 翻轉(zhuǎn)至細胞膜表面，且這一現(xiàn)象在凋亡早期便已發(fā)生。鑒于此，可利用對 PS 具有高度親和力且標記有熒光素的膜連蛋白 V（Annexin V）對早期凋亡細胞進行精準檢測。

不過，由于晚期凋亡細胞以及部分壞死細胞同樣能夠與 Annexin V 相結(jié)合，所以有必要引入另一項評判指標，也就是細胞膜的通透性。與正常細胞和早期凋亡細胞相比，晚期凋亡及壞死細胞的膜通透性顯著增加。如此一來，某些在正常情況下無法進入細胞內(nèi)部的核酸染料，例如 7 - AAD 和 PI，便能夠順利進入細胞內(nèi)與 DNA 相結(jié)合。

綜上所述，借助 Annexin V 和 7 - AAD/PI 雙染的檢測手段，就能夠有效地將早期凋亡細胞與晚期凋亡及壞死細胞清晰地區(qū)分開來，從而為細胞凋亡狀態(tài)的準確判定提供有力依據(jù)。

Annexin V和7-AAD雙標測凋亡流式染色實例

小鼠腹腔巨噬細胞（數(shù)量為每樣 2 - 5×105 個）Annexin V 與 7 - AAD 雙染實例剖析（本實驗中巨噬細胞凋亡由紫外線 30 分鐘照射誘導）

一、標志物特征
活細胞呈現(xiàn) Annexin V - 7 - AAD - ；早期凋亡細胞為 Annexin V + 7 - AAD - ；晚期凋亡及壞死細胞表現(xiàn)為 Annexin V + 7 - AAD + ；特定壞死細胞則是 Annexin V - 7 - AAD + 。

二、流式細胞儀型號
采用 BD FACSCalibur 流式細胞儀進行檢測。

三、流式抗體及用量詳情
使用 1×Binding Buffer（每測試 250ul，聯(lián)科生物的 5×Binding Buffer 用 ddH2O 配制，貨號：LK - AP101 - 100 - BB）；Annexin V - APC（每測試 1ul，貨號：BMS306APC，eBioscience）；7 - AAD（每測試 5ul，貨號：559925，BD）。

四、染色條件說明
本實例運用胰酶消化細胞后進行染色操作，且未對細胞表面分子染色。若需標記表面分子，切不可使用胰酶，應先按常規(guī)染法標記表面分子，洗凈多余抗體后，用 1×Binding Buffer 重懸細胞，再加入 Annexin V 和 7 - AAD，于室溫避光孵育 15 分鐘。因該法中細胞未固定，染色后需盡快開展檢測工作。

五、分析軟件信息
運用 Cell Quest 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

六、圈門策略與染色情況
FSC/SSC 圈門策略依不同細胞類型而定（本實例見上圖）。

七、常見問題及提示
A. 鑒于細胞凋亡受細胞種類、體內(nèi)外環(huán)境、外界刺激以及染色操作等多種因素影響而存在顯著差異，利用 Annexin V 和 7 - AAD 雙染檢測凋亡時，需依據(jù)各自實驗情形開展多次實驗，以精準把握特定實驗條件下細胞凋亡的規(guī)律與特征。
B. Annexin V 染色具有特殊表現(xiàn)，未凋亡細胞（Annexin V - 7 - AAD - 細胞）經(jīng)染色后在流式圖上位置會向右偏移。經(jīng)與眾多從事凋亡研究的同行交流得知，此為 Annexin V 染色特有的現(xiàn)象，無需詫異。曾嘗試通過洗凈多余抗體將活細胞群（Annexin V - 7 - AAD - 細胞群）調(diào)整至常規(guī)認知的 “陰性細胞” 位置，但從實例圖可看出該方法無效。至于洗凈多余抗體無法解決 “移位” 問題的原因，目前尚不明晰，僅建議不要采用此方法調(diào)整細胞在圖中的位置，因為清洗后各群細胞比例會發(fā)生改變。
C. 因?qū)嶒炛屑毎@取不易，本實例采用細胞數(shù)量較少。若實驗細胞數(shù)量充足達 106 級別，可采用 300ul - 500ul 體系，添加 2ul - 5ul Annexin V 和 10ul 7 - AAD，具體染色條件可通過滴度實驗自行確定。
D. 使用 Annexin V 和 PI 試劑盒的人員可依照試劑盒說明書進行染色操作。
E. 該方法上機檢測過程與一般分子上機檢測相似，無特殊之處，無需過度擔憂。使用 PI 的人員需注意，PI 發(fā)射譜較寬，可選用第二或第三通道檢測，任選其一即可。同時，在進行 FSC/SSC 圈門時，所選細胞范圍對結(jié)果影響較大，分析時應將所有分析對象納入 FSC/SSC 門內(nèi)，以確保結(jié)果真實可靠。
F. 本法優(yōu)勢在于無需固定細胞且染色快速，但存在不足，當細胞膜破裂時 Annexin V 也可與細胞結(jié)合，并且在部分自噬受損細胞中，PS 外翻可能受阻，此時 Annexin V 不適用于早期凋亡檢測。

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