做elisa實驗時需要注意哪些問題？

Elisa實驗中應(yīng)該注意的問題,包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題。
1、樣品稀釋 ：
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽性。
2、試劑盒平衡： 
Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠,樣品孵育時間相對縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3、樣品和試劑的混勻： 
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性。
4、加樣： 
加樣是一項很重要的步驟。加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。
5、溫育： 
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合,必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。
6、洗板： 
固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù),需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,以保證ELISA測定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及時更換吸水紙,尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結(jié)果。
7、顯色： 
顯色一定要控制時間,根據(jù)試劑盒說明操作即可。一般來說,顯色時間過短,結(jié)果偏低；顯色時間過長,空白增高或者非特異性顯色增加。
8、比色： 
比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長為450nm,后者為492nm,濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此,容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。

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