過氧化氫（H₂O₂）檢測(cè)試劑盒(硫酸鈦比色法)

一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

過氧化氫(H₂O₂)是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解，H₂O₂不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。生命體內(nèi)積累的H₂O₂是由一些氧化物催化超氧陰離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)而形成，H₂O₂相對(duì)超氧陰離子性質(zhì)穩(wěn)定，但其存在可以直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損害，加速細(xì)胞的衰老和解體，H₂O₂也是許多氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

雅吉生物過氧化氫(H₂O₂檢測(cè)試劑盒(硫酸鈦比色法)其檢測(cè)原理是H₂O₂與硫酸鈦反應(yīng)生成的過氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，溶解于強(qiáng)酸中，其黃色深淺與過氧化氫濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可通過比色法檢測(cè)412nm處吸光度，主要用于檢測(cè)植物組織、血清、血漿等樣品中過氧化氫(H₂O₂)含量。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域不適用于臨床診斷或其他用途。

二、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

1、蒸餾水、丙酮

2、勻漿器或研缽

3、低溫離心機(jī)

4、分光光度計(jì)、比色杯

• 操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品︰

①植物樣品∶取正?；蚰婢诚碌男迈r植物組織，清洗干凈，擦干，切碎，迅速稱取5g ，加入5ml預(yù)冷的丙酮，在冰浴條件下迅速勻漿或研磨，4℃ 12000g離心20min，收集上清液，測(cè)量提取液總體積，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，4℃保存，用于過氧化氫的檢測(cè)。

③高活性樣品∶如果樣品中含有較高濃度的過氧化氫，可以使用丙酮進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、配制10mM H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)溶液∶由于過氧化氫不是非常穩(wěn)定，使用前需自行測(cè)定過氧化氫的實(shí)際濃度，該試劑盒提供的H₂O₂基液的H₂O₂濃度約為1M，用蒸餾水稀釋100倍，使H₂O₂濃度約為10mM，蒸餾水調(diào)零，分光光度計(jì)測(cè)定A₂₄₀，根據(jù)公式H₂O₂濃度(mM)=22.94×A₂₄₀計(jì)算出H₂O₂基液中H₂O₂的實(shí)際濃度，再用丙酮稀釋H₂O₂基液配制10mM H₂O₂丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(一般情況下新配制的10mM H₂O₂基液A₂₄₀為0.4~0.45，3個(gè)月以后A₂₄₀為0.35~0.42)。

按下表依次稀釋(常用濃度0.3-3mM,即1~5號(hào))∶

3. 配制硫酸鈦溶液∶0.3g 硫酸鈦加入 6ml蒸餾水中，即為5%硫酸鈦溶液，4C保存。
4. H₂O₂加樣∶按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡;如果樣品中的H₂O₂濃度過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行管。

5. H₂O₂測(cè)定∶混勻，室溫放置5min ， 12000g離心15min，棄上清液，留取沉淀，如有必要可加入預(yù)冷丙酮反復(fù)洗滌沉淀物，向各管的沉淀中加入2ml酸性基液，搖動(dòng)，使沉淀完全溶解;比色杯光徑1cm，空白管調(diào)零，分光光度計(jì)測(cè)定412nm處各標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管的吸光度，如果沒有分光光度計(jì)，亦可用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

五、計(jì)算:以系列丙酮-H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)(0.3、0.5、0.8、1、3、5、8 mM)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程;以測(cè)定管吸光度代入回歸方程求得待測(cè)樣品中H₂O₂的濃度。

組織樣品H₂O₂(mmol/g)=(C₀×V_T×N)/m

液體樣品H₂O₂ (mmol/L)=C₀×N

式中:

Co=根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線求得H₂O₂濃度(mM)

V_T=待測(cè)樣品的總體積(L)

m=樣品質(zhì)量(g)

N=樣本稀釋倍數(shù)

六、注意事項(xiàng):

1、該試劑盒亦可用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)的樣本數(shù)相應(yīng)增加。

2、加入堿性基液、硫酸鈦溶液時(shí)，應(yīng)直接加入至溶液中，不要粘到管壁。

3、過氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀溶解于酸性基液時(shí)需要一段時(shí)間，需完全溶解，否則有可能影響測(cè)定結(jié)果。

4、H₂O₂基液和堿性基液應(yīng)嚴(yán)格密閉保存，避免揮發(fā)，否則效率會(huì)下降。

5、H₂O₂基液和酸性基液有一定腐蝕性，請(qǐng)小心操作。

6、硫酸鈦溶解于水后應(yīng)盡早使用，如暫時(shí)不用，可短期放置4℃冰箱保存﹔亦可用分析天平稱取一定量的粉劑，配置5%的濃度即可。

7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

七、 有效期∶12個(gè)月有效。

附錄∶標(biāo)準(zhǔn)曲線制作: 雅吉生物在室溫條件下按說明書操作，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行吸光度的測(cè)定，其吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線如下(僅供參考)，我們采用H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)(0.1、0.3、0.5、0.8、1、3.5、8 、10mM)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)品濃度過高或過低都有可能影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性)∶

注意:H₂O₂濃度低于0.3mM基本無色，0.3~1mM為黃色，3~10mM為橙黃色，效果參考如下。