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江蘇金普諾安生物科技股份有限公司

主營產(chǎn)品:蛋白酶K,廣譜核酸酶,葡萄糖脫氫酶等

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這樣使用胰蛋白酶,讓你的細胞培養(yǎng)不再痛苦
發(fā)布日期:2024/11/27 10:42:56發(fā)布人:江蘇金普諾安生物科技股份有限公司

貼壁細胞是指在體外培養(yǎng)中附著在培養(yǎng)容器底部或壁上的細胞。當這些細胞生長到一定密度,或者為了進行其他實驗時,就需要對其進行消化傳代,胰蛋白酶在這個過程中扮演著關鍵的角色。今天小編就給大家盤點下它在貼壁細胞傳代中的注意事項~

 

貼壁細胞的傳代

細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后需要將其稀釋分種成多瓶,細胞才能繼續(xù)生長,這一過程也叫「傳代」。當貼壁細胞處于對數(shù)生長期,且匯合度達到80%時,即可傳代。

 

 

胰蛋白酶的作用原理

胰蛋白酶的酶切位點是肽鏈的Lys或Arg兩個殘基的羧基端肽鏈,通過在特定位置上降解蛋白,使細胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解,從而使兩者分離。這時,細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。

 

 

貼壁細胞傳代中如何使用胰蛋白酶

 

胰蛋白酶在貼壁細胞傳代的過程中被用來水解細胞外基質(zhì)和細胞膜上的蛋白質(zhì),從而減弱細胞與培養(yǎng)容器或其他細胞的黏附力。下面是使用其進行貼壁細胞傳代的一般步驟:

 

1.檢查細胞狀態(tài):在進行傳代前,首先要在顯微鏡下檢查細胞的生長狀態(tài)和密度,確保它們已經(jīng)達到適宜傳代的生長階段。

 

2.清洗細胞:先將瓶中的培養(yǎng)基棄掉,并用生理鹽水或1×PBS清洗2-3次,以最大限度地清除瓶內(nèi)培養(yǎng)基的殘留(培養(yǎng)基中所含的胎牛血清對胰蛋白酶的消化起抑制作用)。

 

3.加入胰蛋白酶溶液:加入少量消化液,蓋過細胞即可。胰蛋白酶作用于賴氨酸或精氨酸的C末端,在37°C具有最佳的效率。將培養(yǎng)瓶放入溫箱中處于37°C孵育(孵育的時間因細胞特性的變化而變化,并沒有固定的時間),消化程度通過顯微鏡觀察細胞的形態(tài)即可進行判斷。

 

4.監(jiān)控細胞分離:在顯微鏡下觀察大部分細胞會皺縮變圓,此時則視為消化完畢;或者用移液器吹打細胞發(fā)現(xiàn)細胞剛好可以被吹打下來。如果發(fā)現(xiàn)消化不足,可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

 

圖1 貼壁細胞消化前(左)和消化后(右)

(圖源于網(wǎng)絡)

 

5.停止胰蛋白酶作用:一旦細胞分離,應立即加入含有血清的培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶的消化作用,以防止消化過度對細胞造成不可逆損傷。使用重組胰蛋白酶則無需血清終止。

 

6.收集和分散細胞:用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中,并通過離心來分離細胞。丟棄上清液,加培養(yǎng)液并用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

 

如何選擇合適的胰蛋白酶 

不同的細胞加入胰蛋白酶的成分和濃度不一樣,不能一味的選擇消化能力強的胰蛋白酶,否則會消化過度,損傷細胞。

 

貼壁不牢和半貼壁細胞:盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰蛋白酶且不需要放在培養(yǎng)箱孵育,這樣易于控制,對細胞的傷害也降到最低。

 

貼壁性較強的細胞:需要使用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶,消化細胞時間不宜過長。

 

 

在細胞培養(yǎng)中,EDTA常常用來螯合鈣離子和鎂離子,這對于阻斷某些離子依賴性的細胞黏附過程非常重要。與胰蛋白酶一同使用,幫助分離貼壁細胞。

 

酚紅在不同pH值下會呈現(xiàn)不同顏色,因此通過觀察培養(yǎng)基的顏色,研究人員可以直觀地判斷培養(yǎng)環(huán)境的pH是否處于適宜細胞生長的范圍。

 

重組胰蛋白酶具有與動物源性相同的酶學性質(zhì),但不含任何動物源成分,可替代胰蛋白酶使用,消化后可通過基礎培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基稀釋降低活性,無需血清終止。之前發(fā)布的文章中提到過,重組胰蛋白酶無外源性病毒污染,而采用傳統(tǒng)提取的酶可能存在支原體等污染,由于其酶蛋白活性不穩(wěn)定,還會影響到細胞消化的結(jié)果。

 

金普諾安|重組胰蛋白酶 

 

金普諾安重組胰蛋白酶是由微生物基因重組表達生產(chǎn),氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶一致,且具有與動物源性豬胰蛋白酶相同的酶學性質(zhì),可替代豬胰腺來源胰蛋白酶應用于各種生物技術過程中,如:重組胰島素生產(chǎn)、細胞培養(yǎng)、細胞發(fā)酵、蛋白質(zhì)的酶解以及各種組織的細胞分離等。胰蛋白酶活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑如PMSF等的抑制,金屬離子螯合劑如EDTA等也能抑制酶活。

 

產(chǎn)品優(yōu)勢

無動物源性:重組生產(chǎn),無外源性的病毒污染,不使用任何動物源原料;

質(zhì)量穩(wěn)定:產(chǎn)品批次間無差異,可保證穩(wěn)定連續(xù)的批次生產(chǎn);

純度高:比活高;

宿主蛋白殘留小于生物制品限度要求;

凍干粉:易于儲存和運輸;

符合法規(guī)要求:生產(chǎn)設備和生產(chǎn)環(huán)境符合相關法規(guī)要求,生產(chǎn)過程遵循 ISO9001:2015 質(zhì)量體系。

 

訂購信息

 

注意事項

1.為何細胞難以脫離培養(yǎng)瓶?

A可能是胰蛋白酶活力不足或者使用的濃度較低,也可能是高匯合度和酶不能進入細胞基質(zhì)的界面,以及未清洗的細胞內(nèi)含有血清抑制了胰酶活性??墒褂眯迈r批次和最佳濃度的酶,或徹底清洗移除血清,或在低細胞濃度時解離細胞。

 

2.什么時候表示消化好了?

A并不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才表示消化結(jié)束,一般肉眼觀察貼壁細胞層,只要能移動了,多半呈沙狀移動就可以了,這時就應該停止消化。

 

——文中部分插圖源自攝圖網(wǎng),已獲授權


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