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全能型DNA建庫試劑盒

2019/6/5 9:48:26

背景[1-6]

全能型DNA建庫試劑盒是針對Illumina®高通量測序平臺定向優(yōu)化而成的新一代建庫試劑盒。全能型DNA建庫試劑盒采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成,簡化的操作流程,可顯著提高低質(zhì)量樣本文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率,具有廣泛的樣本適應(yīng)性,同時(shí)兼容FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本,助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。全能型DNA建庫試劑盒建庫方法運(yùn)用高活性的轉(zhuǎn)座酶,完成DNA的片段化和加接頭,具有快速、操作簡單和低建庫起始量的優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是插入序列具有偏好性,對DNA的純度和DNA濃度準(zhǔn)確性要求較高。

全能型DNA建庫試劑盒采用轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)插入并將基因組DNA打斷成長度大小為300bp左右的片段,同時(shí)將測序所需的adaptor直接在插入打斷的同時(shí)連接到片段的兩端,縮短了建庫時(shí)間、減少了樣品的需求量,因此特別適合樣品量有限的應(yīng)用,如腫瘤活檢、降解的DNA或純化的DNA。

技術(shù)流程:(1)DNA待測文庫構(gòu)建

利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段,目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外,主要是打斷成200-500bp長的序列片段,并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭,構(gòu)建出單鏈DNA文庫。

(2)Flowcell

Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道,當(dāng)文庫建好后,這些文庫中的DNA在通過flowcell的時(shí)候會隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel,每個(gè)channel的表面都附有很多接頭,這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對(這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因),并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增。

(3)橋式PCR擴(kuò)增與變性

橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板,進(jìn)行橋形擴(kuò)增。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán),最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束,每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA模板的很多分拷貝,進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號強(qiáng)度放大,以達(dá)到測序所需的信號要求。

(4)測序

測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP(如同Sanger測序法)。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù),因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后,所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著,再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液,用激光激發(fā)熒光信號,并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄,最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。

這樣熒光信號記錄完成后,再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán),以便能進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題,它的主要測序錯(cuò)誤來源是堿基的替換,目前它的測序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間,測序周期以人類基因組重測序?yàn)槔?0x測序深度大約為1周。

操作注意:

1.為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2.請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,短暫離心后置于冰上待用。

3.配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩,劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4.為避免樣品交叉污染,推薦使用帶濾芯的槍頭,吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭。

5.推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng),使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6.PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離;使用專用的移液器等設(shè)備;并定時(shí)對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔(使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理),以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

應(yīng)用[7][8]

全能型DNA建庫試劑盒可用于二代測序DNA文庫構(gòu)建:

近兩年來,隨著二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展完善,ctDNA檢測的敏感性及特異性有了顯著提升,這也給ctDNA的早期腫瘤診斷提供了更多的可能。循環(huán)游離DNA(Circulating free DNA,cfDNA)的檢測逐漸成為腫瘤領(lǐng)域新的熱點(diǎn)和趨勢,其中來源于腫瘤組織或細(xì)胞的DNA稱為循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)。

但目前大多數(shù)cfDNA的研究均集中于晚期腫瘤的治療評估、耐藥復(fù)發(fā)及療效監(jiān)測。早期腫瘤患者由于其腫瘤負(fù)荷低,因而cfDNA豐度及ctDNA比例均明顯低于晚期腫瘤患者,不易進(jìn)行檢測與評估?;诙鷾y序技術(shù)的cfDNA拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations,CNVs)檢測在晚期腫瘤中研究較多,但早期腫瘤領(lǐng)域鮮有人涉足。著眼于早期肺癌cfDNA的CNVs檢測,通過肺癌患者與肺部炎癥患者組織標(biāo)本及血漿cfDNA的CNVs對比,嘗試提出腫瘤早期診斷的另一途徑。

參考文獻(xiàn)

[1]Cancer statistics in China,2015[J].Wanqing Chen,Rongshou Zheng,Peter D.Baade,Siwei Zhang,Hongmei Zeng,Freddie Bray,Ahmedin Jemal,Xue Qin Yu,Jie He.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2016(2)

[2]Genomic variations in plasma cell free DNA differentiate early stage lung cancers from normal controls[J].Shu Xia,Chiang-Ching Huang,Min Le,Rachel Dittmar,Meijun Du,Tiezheng Yuan,Yongchen Guo,Yuan Wang,Xuexia Wang,Susan Tsai,Saul Suster,Alexander C.Mackinnon,Liang Wang.Lung Cancer.2015(1)

[3]Circulating tumor DNA as a non-invasive substitute to metastasis biopsy for tumor genotyping and personalized medicine in a prospective trial across all tumor types[J].Ronald Lebofsky,Charles Decraene,Virginie Bernard,Maud Kamal,Anthony Blin,Quentin Leroy,Thomas Rio Frio,Ga?lle Pierron,Céline Callens,Ivan Bieche,Adrien Saliou,Jordan Madic,Etienne Rouleau,Fran?ois-Clément Bidard,Olivier Lantz,Marc-Henri Stern,Christophe Le Tourneau,Jean-Yves Pierga.Molecular Oncology.2014

[4]Cancer biomarker discovery:Current status and future perspectives[J].Katrin Mä,bert,Monica Cojoc,Claudia Peitzsch,Ina Kurth,Serhiy Souchelnytskyi,Anna Dubrovska.International Journal of Radiation Biology.2014(8)

[5]Serum SALL4 Is a Novel Prognosis Biomarker with Tumor Recurrence and Poor Survival of Patients in Hepatocellular Carcinoma[J].Su-xia Han,Jun-lan Wang,Xi-jing Guo,Chen-chen He,Xia Ying,Jin-lu Ma,Yuan-yuan Zhang,Qian Zhao,Qing Zhu,Kurt Blaser.Journal of Immunology Research.2014

[6]Cancer statistics,2014[J].Rebecca Siegel,Jiemin Ma,Zhaohui Zou,Ahmedin Jemal.CA A Cancer Journal for Clinicians.2014(1)

[7]Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors as initial therapy for non-small cell lung cancer:Focus on epidermal growth factor receptor mutation testing and mutation-positive patients[J].Monic Roengvoraphoj,Gregory J.Tsongalis,Konstantin H.Dragnev,James R.Rigas.Cancer Treatment Reviews.2013(8)

[8]翁琳倩.基于二代測序的早期肺腺癌血漿游離DNA的拷貝數(shù)目檢測[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2016.

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