背景^[1-3]

MARK4抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

MARK4（MAP/微管親和調(diào)節(jié)激酶4）也稱為KIAA1860、MARKL1，屬于CAMK絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族和SNF1亞家族。它直接參與神經(jīng)元細胞中的微管組織，并可能導(dǎo)致阿爾茨海默病中tau的病理磷酸化，并且在肝細胞癌變中也起作用。該蛋白質(zhì)具有2種通過選擇性剪接產(chǎn)生的亞型，分子量分別為83 kDa和75 kDa。MARK4除了全長亞型84 kDa外，還可以在阿爾茨海默病和非癡呆老年人病例的海馬勻漿中以40-65 kDa的形式存在。

MARK4抗體

MARK4抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（MARK4抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(MARK4抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

MARK4抗體可以用于MiR-150和RNA結(jié)合蛋白DAZAP1調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學(xué)行為的分子機制研究

研究旨在為膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的依據(jù),同時為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供新靶標(biāo)。

研究方法:首先培養(yǎng)人的膠質(zhì)瘤細胞U87、U251,人正常星型膠質(zhì)細胞。應(yīng)用Real-time PCR檢測miR-150、FOXB1、DAZAP1、Linc00598、FOXE1,應(yīng)用Western blot檢測FOXB1、DAZAP1、FOXE1在正常腦組織、膠質(zhì)瘤組織、人正常星型膠質(zhì)細胞中的表達水平。應(yīng)用CCK-8檢測細胞增殖能力的改變。采用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力的改變。應(yīng)用流式細胞儀和PI-FITC雙染色檢測細胞凋亡能力。應(yīng)用通過細胞轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建miR-150、FOXB1、DAZAP1、Linc00598、FOXE1過表達和表達沉默的細胞系。Real-time PCR方法檢測XIAP、MMP9、FOXE1、MARK4的mRNA的表達變化。MARK4抗體Western Blot方法檢測XIAP、MMP9、FOXE1、MARK4、STAU1、UPF1、LATS、p-LATS、MST、p-MST、YAP、p-YAP抗體蛋白的表達變化。雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)實驗檢測miR-150和FOXB1、Linc00598和FOXE1的靶向結(jié)合作用。應(yīng)用放線菌素D-3誘導(dǎo)實驗測定Linc00598的半衰期改變。

應(yīng)用RIP和RNA-pulldown實驗驗證DAZAP1和Linc00598、Linc00598和FOXE1的結(jié)合。應(yīng)用免疫共沉淀法檢測FOXB1與MMP9和XIAP、FOXE1與MARK4啟動子的直接作用。裸鼠移植瘤實驗檢測miR-150、FOXB1對裸鼠移植瘤的生長和荷瘤裸鼠生存時間的影響。

MARK4抗體結(jié)果:膠質(zhì)瘤組織中miR-150的表達明顯低于瘤周組織和正常腦組織中的表達,且隨膠質(zhì)瘤病理級別的升高而表達降低,U87和U251細胞中的miR-150的表達也顯著低于正常人腦膠質(zhì)細胞。過表達miR-150顯著抑制U87和U251細胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡;沉默miR-150顯著增強U87和U251細胞的增殖,遷移和侵襲能力,抑制細胞凋亡。FOXB1在膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào),且隨膠質(zhì)瘤病理級別的升高而表達升高,U87和U251細胞中的FOXB1的表達也顯著高于正常人腦膠質(zhì)細胞。過表達FOXB1顯著增強U87和U251細胞的增殖,遷移和侵襲能力,抑制細胞凋亡;沉默F(xiàn)OXB1顯著抑制U87和U251細胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡。miR-150與FOXB1存在靶向結(jié)合作用。過表達miR-150通過負性調(diào)控FOXB1,降低MMP9和XIAP的表達,抑制U87和U251細胞的惡性生物學(xué)行為。FOXB1與MMP9和XIAP的啟動子區(qū)存在結(jié)合。過表達mi R-150聯(lián)合沉默F(xiàn)OXB1明顯抑制裸鼠移植瘤的生長和延長荷瘤裸鼠的生存期。DAZAP1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中內(nèi)源性表達,且在膠質(zhì)瘤組織和細胞中表達顯著下調(diào)。過表達DAZAP1顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡。Linc00598在膠質(zhì)瘤組織和細胞中內(nèi)源性表達,且在膠質(zhì)瘤組織和細胞中表達顯著下調(diào)。過表達miR-217顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡。

參考文獻

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