背景^[1-3]

IRAK2抗體是一種可以特異性結(jié)合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的IRAK2蛋白。IRAK2抗體可用于多種科學應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

促炎細胞因子IL-1通過其受體的兩個亞基IL-1受體I（IL-1RI）和IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP）誘導細胞反應(yīng)。IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）介導NF-kB的激活，NF-kB是介導炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。最近發(fā)現(xiàn)了IRAK/Pelle家族中的一個新成員，并將其命名為IRAK2（1）。IRAK和IRAK2在IL-1結(jié)合后募集到IL-1R復合物的亞基并導致NF-kB激活。IRAK還與Toll樣受體（TLR）相關(guān)，IRAK的顯性陰性突變體會抑制LPS誘導的NF-kB激活（2,3）。IRAK/Pelle家族的成員在IL-1R和TLR介導的炎癥反應(yīng)中起核心作用。

IRAK2抗體

IRAK2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（IRAK2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(IRAK2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

IRAK2抗體可以用于miR-424-5p/miR-322-5p通過靶向IRAK2對LPS誘導的奶牛子宮內(nèi)膜炎的調(diào)控機制的研究

探索mi RNAs對于機體生理功能和病理發(fā)展的影響,仍需進行更為全面的研究。本研究中,首先通過q PCR顯示mi R-424-5p或其小鼠同源基因mi R-322-5p在子宮內(nèi)膜炎組織中的表達變化。隨后,分別通過組織病理學、q PCR、Western blot、免疫熒光等實驗探索了mi R-424-5p在LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用和潛在的調(diào)控機制。最后,通過IRAK2抗體雙熒光素酶基因報告實驗證實了mi R-424-5p可通過靶向3′-UTR而抑制IRAK2的表達。

IRAK2抗體結(jié)果表明:mi R-424-5p的超表達可以顯著降低促炎細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的產(chǎn)生,而抑制mi R-424-5p的表達則有明顯相反的作用,并最終證明mi R-424-5p是通過抑制IRAK2的表達抑制NF-κB p65的激活而抑制子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生和發(fā)展。綜上所述,本論文主要研究了mi R-424-5p調(diào)控LPS誘導炎癥的具體作用機制,并為奶牛子宮內(nèi)膜炎及其他炎癥相關(guān)疾病的治療提供了新的靶點和思路。

參考文獻

[1]MicroRNA:Could It Play a Role in Bovine Endometritis?[J].Talha Umar;Baoyi Yin;Saqib Umer;Xiaofei Ma;Kangfeng Jiang;Zaima Umar;Muhammad Akhtar;Aftab Shaukat;Ganzhen Deng.Inflammation.2021

[2]A narrative review of the roles of the miR-15/107 family in heart disease:lessons and prospects for heart disease.[J].Zheng Manni;Wang Min.Annals of translational medicine.2021

[3]Rational Design of Multistage Drug Delivery Vehicles for Pulmonary RNA Interference Therapy[J].Sofia Silva A.;Shopsowitz Kevin E.;Correa Santiago;Morton Stephen W.;Dreaden Erik C.;Casimiro Teresa;Aguiar Ricardo Ana;Hammond Paula T..International Journal of Pharmaceutics.2020

[4]TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling[J].Anna Ciesielska;Marta Matyjek;Katarzyna Kwiatkowska.Cellular and Molecular Life Sciences.2020

[5]王詩.miR-424-5p/miR-322-5p通過靶向IRAK2對LPS誘導的奶牛子宮內(nèi)膜炎的調(diào)控機制的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學,2021.