背景^[1-3]

HEC1抗體是一種IgG2bκ小鼠單克隆Hec1抗體（也稱為Hec1抗體），可通過WB、IP、IF和ELISA檢測小鼠、大鼠和人類來源的Hec1蛋白。Hec1抗體（C-11）既可作為非偶聯(lián)的抗Hec1抗體形式，也可作為多種偶聯(lián)形式的抗Hec1抗體，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種Alexa Fluor?偶聯(lián)物。在癌癥中高表達(dá)（Hec1）是一種富含卷曲的蛋白質(zhì)，在快速分裂細(xì)胞的S和M期大量表達(dá)，并定位于動粒。Hec1參與紡錘體檢查點信號傳導(dǎo)。Hec1在終末分化的細(xì)胞中不表達(dá)。Hec1在包括睪丸、脾臟和胸腺在內(nèi)的有絲分裂率較高的組織中表達(dá)。Hec1也存在于膀胱癌細(xì)胞的晚期S至M期。在細(xì)胞分裂中，Hec1需要招募Mps1激酶和MAD1/MAD2復(fù)合物到著絲粒。Nek2對Hec1絲氨酸165的磷酸化對于忠實的染色體分離至關(guān)重要。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白與Hec1的結(jié)合也增加了染色體分離的保真度。

HEC1抗體

HEC1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（HEC1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(HEC1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

HEC1抗體可以用于有機(jī)氯農(nóng)藥下調(diào)心臟Hec1表達(dá)及影響大鼠卵泡發(fā)育的分子機(jī)制研究

探究了PCNB下調(diào)心臟Hec1表達(dá)及影響卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。我們以H9c2和HL-1心肌細(xì)胞作為實驗材料,用不同濃度PCNB進(jìn)行處理,HEC1抗體Western blot檢測結(jié)果表明PCNB暴露顯著降低Hec1蛋白表達(dá)水平。為了探究PCNB下調(diào)Hec1的分子機(jī)制,我們克隆并鑒定了Hec1的啟動子區(qū),通過Jaspar和hTF target軟件預(yù)測了Hec1啟動子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)合PCNB處理組E17.5胎鼠心臟獲得的差異表達(dá)基因,候選壓力響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄因子ATF3進(jìn)行后續(xù)研究。利用對照和PCNB處理組心臟組織進(jìn)行Real time PCR檢測,證實PCNB顯著下調(diào)心臟組織ATF3的轉(zhuǎn)錄水平。

HEC1抗體免疫組化結(jié)果顯示,ATF3在PCNB處理組的E17.5胎鼠心臟組織中表達(dá)量明顯減少。用不同濃度PCNB處理H9c2和HL-1細(xì)胞后,Western blot結(jié)果顯示ATF3的蛋白表達(dá)水平顯著降低。這些結(jié)果與PCNB下調(diào)心臟組織和體外心肌細(xì)胞的Hec1的表達(dá)一致。為了探究ATF3與Hec1之間的調(diào)控關(guān)系,我們構(gòu)建Myc-ATF3真核表達(dá)質(zhì)粒,將空載體、Myc-ATF3表達(dá)質(zhì)粒和Hec1啟動子報告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK293ET細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)ATF3能激活Hec1啟動子。

將空載體和Myc-ATF3表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293ET和H9c2細(xì)胞,Real-time PCR檢測表明ATF3過表達(dá)顯著升高Hec1的mRNA水平,而特異性靶向ATF3的siRNA分別轉(zhuǎn)染HEK293ET和H9c2細(xì)胞后都顯著降低Hec1的mRNA水平。HEC1抗體Western blot結(jié)果顯示ATF3過表達(dá)顯著升高Hec1的蛋白水平,而ATF3敲低顯著降低Hec1的蛋白水平。我們進(jìn)一步通過Jaspar軟件預(yù)測分析ATF3結(jié)合在Hec1啟動子的位點,發(fā)現(xiàn)Hec1啟動子區(qū)-26/-19位點存在ATF3可能識別的ATF/CRE元件,構(gòu)建針對-26/-19區(qū)域的缺失和點突變報告質(zhì)粒,進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?結(jié)果顯示-26/-19元件的缺失突變和點突變都顯著降低了ATF3對Hec1啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用,表明Hec1啟動子區(qū)的ATF/CRE元件介導(dǎo)了ATF3的轉(zhuǎn)錄激活作用。染色質(zhì)免疫沉淀實驗結(jié)果顯示ATF3能結(jié)合含ATF/CRE元件的區(qū)域。

參考文獻(xiàn)

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[3]Environmental Risk Factors and Congenital Heart Disease:An Umbrella Review of 165 Systematic Reviews and Meta-Analyses With More Than 120 Million Participants[J].Zhang Tie Ning;Wu Qi Jun;Liu Ya Shu;Lv Jia Le;Sun Hui;Chang Qing;Liu Chun Feng;Zhao Yu Hong.Frontiers in Cardiovascular Medicine.2021

[4]The genetics of left ventricular noncompaction[J].Cannie Douglas;Elliott Perry.Current Opinion in Cardiology.2021

[5]淡清華.有機(jī)氯農(nóng)藥下調(diào)心臟Hec1表達(dá)及影響大鼠卵泡發(fā)育的分子機(jī)制研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2022.