背景^[1-3]

PTGER2抗體是一種可以特異性結(jié)合PTGER2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PTGER2蛋白。PTGER2抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

PTGER2抗體

PTGER2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（PTGER2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(PTGER2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

PTGER2抗體可以用于腫瘤微環(huán)境中性粒細(xì)胞通過PGE2/PTGER2通路調(diào)控甲狀腺未分化癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

在中性粒細(xì)胞作用下,利用Transwell實驗篩選出中性粒細(xì)胞相關(guān)的高遷移ATC細(xì)胞(neutrophils assotiated high-migration ATC cells,NAHMC),以及中性粒細(xì)胞不能誘導(dǎo)遷移的ATC細(xì)胞亞群(not-migrated cells,NMC);轉(zhuǎn)錄組測序挑選出差異表達(dá)的膜受體基因;Western blot、Real-time PCR檢測驗證差異基因在NAHMC和NMC單克隆細(xì)胞株中的表達(dá),以及PTGER2抗體免疫組化檢測差異蛋白在ATC、PTC及正常甲狀腺組織的表達(dá);Transwell實驗、劃痕實驗、平板克隆、CCK8實驗檢測敲低PTGER2表達(dá)及PTGER2受體拮抗劑作用后中性粒細(xì)胞對ATC細(xì)胞的遷移和增殖能力影響;構(gòu)建穩(wěn)定敲除PTGER2的ATC細(xì)胞并通過Western blot實驗驗證敲除效率;裸鼠動物實驗中,利用小動物成像系統(tǒng)檢測敲除PTGER2對ATC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響。

PTGER2抗體ELISA檢測ATC細(xì)胞上清作用中性粒細(xì)胞后前列腺素PGE2濃度的改變;Transwell實驗、劃痕實驗、平板克隆、CCK8實驗檢測PGE2對ATC細(xì)胞遷移和增殖能力的影響;Western blot、Real-time PCR檢測PGE2作用ATC細(xì)胞后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá);相關(guān)通路抑制劑作用細(xì)胞及Transwell實驗驗證PGE2激活A(yù)TC細(xì)胞相關(guān)信號通路進(jìn)而促進(jìn)ATC細(xì)胞遷移。

TIMER數(shù)據(jù)庫檢索甲狀腺癌中PTGER2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤程度、CXCL1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤程度、PTGER2與CXCL1表達(dá)的相關(guān)性;細(xì)胞因子芯片及ELISA檢測NAHMC與NMC單克隆細(xì)胞、NAHMC與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后的上清中細(xì)胞因子相對定量分析;PTGER2抗體ELISA及Real-time PCR檢測敲低PTGER2、PGE2刺激或相關(guān)通路抑制劑作用ATC細(xì)胞后CXCL1的蛋白及mRNA表達(dá)。

[結(jié)果]組織切片HE染色顯微鏡下發(fā)現(xiàn),ATC組織中有大量的中性粒細(xì)胞浸潤。免疫組化也證實CD66b在ATC組織中高表達(dá),然而PTC(papillary thyroid carcinoma,PTC)組織及正常甲狀腺組織卻較少中性粒細(xì)胞浸潤及CD66b表達(dá);Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞與ATC細(xì)胞無論是直接還是間接共培養(yǎng),均能促進(jìn)ATC細(xì)胞的遷移能力。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)NAHMC中前列腺素受體PTGER2表達(dá)顯著高于NMC;Real-time PCR、PTGER2抗體Western blot及免疫組化結(jié)果提示ATC細(xì)胞的PTGER2 mRNA和蛋白的表達(dá)高于PTC及正常甲狀腺上皮細(xì)胞;敲低ATC細(xì)胞PTGER2表達(dá)以及PTGER2拮抗劑(PF-04418948)預(yù)處理細(xì)胞后,中性粒細(xì)胞促進(jìn)ATC細(xì)胞的遷移能力顯著下降,同時發(fā)現(xiàn)PF-04418948并不影響細(xì)胞活力;PTGER4抑制劑(E7046)和PTGFR抑制劑(AL-8810)對ATC細(xì)胞遷移能力無明顯影響;裸鼠移植瘤動物實驗中,小動物成像系統(tǒng)結(jié)果提示敲除PTGER2顯著抑制ATC細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

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