背景^[1-3]

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒是一種通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)（Elisa）原理特異性識(shí)別樣本中人結(jié)腸癌抗原(CCA）的商品化試劑盒。人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒可以通過(guò)識(shí)別樣本中人結(jié)腸癌抗原(CCA)的類(lèi)別及含量為科研及臨床診斷提供依據(jù)。

需要注意的是若用于臨床診斷的Elisa試劑盒需取得上市所在國(guó)的醫(yī)療器械資質(zhì)。同時(shí)人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒的診斷結(jié)論存在一定的局限性，受限于樣本保存不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，方法學(xué)靈敏度等原因不能作為臨床判斷的唯一依據(jù)。

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒技術(shù)原理：方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒操作流程如下:

(1)待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl,每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔;設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μl。

(2)酶標(biāo)板置4℃,包被過(guò)夜。

(3)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過(guò)洗一遍(將洗滌液注滿(mǎn)板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿(mǎn)板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。

(4)陰性對(duì)照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的抗體工作液50μl。

(5)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀釋的抗體工作液100μl。

(8)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應(yīng)15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

(12)分別測(cè)450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,測(cè)得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

(13)數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的OD值后,計(jì)算S/N值。

應(yīng)用^[4][5]

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒可以用于基于MHCⅠ類(lèi)分子親和力篩選的人結(jié)腸癌新抗原肽的臨床免疫效應(yīng)研究

研究通過(guò)對(duì)人結(jié)腸癌全外顯子測(cè)序的生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)新抗原,確定其所結(jié)合的MHC(人類(lèi)為HLA)分子親和力。體外模擬抗原提呈過(guò)程對(duì)腫瘤新生抗原肽進(jìn)行免疫原性檢測(cè),闡述新抗原肽的免疫原性與其MHCⅠ類(lèi)分子親和力變化度及MHCⅠ等位基因型之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上形成快速發(fā)現(xiàn)有效新抗原的新方法。

方法:1.采用NGS測(cè)序技術(shù)對(duì)患者腫瘤組織進(jìn)行全外顯子測(cè)序,獲得腫瘤的全外顯子基因組數(shù)據(jù)。2.通過(guò)Net-MHC4.0等軟件預(yù)測(cè)(9肽)新抗原肽,確定其所結(jié)合的MHC I等位基因和分子親和力。3.由生物公司根據(jù)新抗原多肽的氨基酸序列,合成新抗原多肽。4.體外誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(im DC)。5.制備負(fù)載新抗原多肽的DC疫苗。6.進(jìn)行DC疫苗與PBMC共培養(yǎng)。7.采用人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)技術(shù)量化新抗原多肽的免疫原性。8.以流式細(xì)胞技術(shù)鑒定成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(m DC)及最后共培養(yǎng)混合細(xì)胞中T、B、NK等各免疫細(xì)胞的百分比。

人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒結(jié)果:1.通過(guò)NGS測(cè)序技術(shù)及生物信息分析技術(shù)預(yù)測(cè)了共222種新抗原肽(來(lái)自6例結(jié)腸癌患者標(biāo)本),明確了其等位基因及其MHC分子親和力等信息。2.通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)證明成功制備92種負(fù)載新抗原多肽的DC疫苗,其中CD11c+、CD83+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞群97.4%,CD80+、CD86+占淋巴細(xì)胞群97.4%。

3.采用人結(jié)腸癌抗原(CCA)Elisa試劑盒ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)(T值)量化每種新抗原肽的免疫原性,將每個(gè)病人的T值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化到同一量綱水平,Two-Way ANOVA分析結(jié)果:HLA親和力變化度區(qū)間在1-4(Group B)標(biāo)準(zhǔn)化T值水平,明顯高于≤1(Group A)標(biāo)準(zhǔn)化T值水平和>4(Group C)標(biāo)準(zhǔn)化T值水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T值最高的新抗原的HLA親和力變化度位于1-4之間。4.將每種肽的HLA-Ⅰ等位基因型進(jìn)行分類(lèi),所結(jié)合新抗原肽數(shù)量最多的為HLA-Ⅰtype1,其次為HLA-Ⅰtype2,結(jié)合新抗原肽數(shù)量最少的為HLA-Ⅰtype3,Two-Way ANOVA分析結(jié)果:HLA-Ⅰtype1標(biāo)準(zhǔn)化T值水平,明顯高于HLA-Ⅰtype2和HLA-Ⅰtype3標(biāo)準(zhǔn)化T值水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T值最高的新抗原的HLA-Ⅰ等位基因型為HLA-Ⅰtype1。5.最終培養(yǎng)3周后的混合細(xì)胞做流式細(xì)胞分析顯示:CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+)所占比例為37.41%,CD8+T細(xì)胞(CD3+CD8+)所占比例為16.67%,NK細(xì)胞(CD3-CD56+)所占比例為33.09%,B細(xì)胞(CD3-CD19+)所占比例為0.84%,表明新抗原肽不僅對(duì)CD8+T細(xì)胞具有增殖活化作用,同時(shí)對(duì)CD4+T細(xì)胞及NK細(xì)胞也有促進(jìn)增殖作用。

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