背景^[1-3]

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒是一種通過酶聯(lián)免疫技術（Elisa）原理特異性識別樣本中人NOD樣受體(NLR)的商品化試劑盒。人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒可以通過識別樣本中人NOD樣受體(NLR)的類別及含量為科研及臨床診斷提供依據(jù)。

需要注意的是若用于臨床診斷的Elisa試劑盒需取得上市所在國的醫(yī)療器械資質(zhì)。同時人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒的診斷結(jié)論存在一定的局限性，受限于樣本保存不當、實驗操作不規(guī)范，方法學靈敏度等原因不能作為臨床判斷的唯一依據(jù)。

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒技術原理：ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒操作流程如下:

(1)待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設3個平行孔;設兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設一個空白對照孔,加入純細胞裂解液100μl。

(2)酶標板置4℃,包被過夜。

(3)洗板:吸干孔內(nèi)反應液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。

(4)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的抗體工作液50μl。

(5)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀釋的抗體工作液100μl。

(8)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。

(12)分別測450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,測得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

(13)數(shù)據(jù)處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的OD值后,計算S/N值。

應用^[4][5]

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒可以用于Nods樣模式識別受體在變應性鼻炎患者鼻黏膜中的表達及意義

探討Nods(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域,Nod Like receptors)樣模式識別受體(PRR)在變應性鼻炎患者下鼻甲黏膜組織中的表達及作用,并研究變應性鼻炎下鼻甲黏膜IL-4、IL-6、IL-10、IFN-r的表達情況,以鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜、鼻息肉做對照。提取變應性鼻炎外周血單個核細胞,比較變應性鼻炎患者脫敏治療6個月前后單個核細胞Nod1表達的變化,及脫敏治療前后血清、鼻分泌物中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ變化情況,探索Nodl表達變化和細胞因子變化之間的關系。

方法:2011年9月至2012年9月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院門診變應性鼻炎(AR)患者,根據(jù)AIRA2010(依據(jù)臨床表現(xiàn)、鼻腔檢查情況、皮膚點刺實驗結(jié)果或血清變應原特異性IgE檢測)入組；對照組1：期間因鼻中隔偏曲行單純鼻中隔偏曲矯正術患者；對照組2：慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP,chronic rhinosinusitis with nasal polyps)住院患者(根據(jù)EPOS2007指南標準納入研究組)。本項研究得到了南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院倫理委員會的批準,且征得所有研究對象知情簽字同意。分別采用real-time RT-PCR、人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒、western-blot及免疫組織化學檢測Nod1、od2、NALP3mRNA及蛋白在變應性鼻炎患者下鼻甲黏膜(患者下鼻甲黏膜,以下簡稱黏膜)表達,以鼻中隔偏曲患者代償側(cè)下鼻甲黏膜、鼻息肉粘膜做對照。人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒測變應性鼻炎黏膜(組織勻漿液)IL-4、L-6、IL-10、IFN-γ的表達量,以鼻中隔偏曲下鼻甲黏膜,鼻息肉組織做對照。western-blot測變應性鼻炎患者舌下特異性免疫脫敏治療6個月前后外周血單個核細胞Nod1的表達變化。人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒ELISA測變應性鼻炎患者脫敏治療6個月前后血清、鼻腔分泌物IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ表達變化。

人NOD樣受體(NLR)Elisa試劑盒結(jié)果：1.Real-Time RT-PCR顯示：變應性鼻炎黏膜組織Nod1mRNA表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.31,P=0.00),NALP3mRNA表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2mRNA表達與正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉比較無明顯差別,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.06,P=0.10)。2.western-blot結(jié)果提示：變應性鼻炎黏膜組織Nod1表達低于正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉組(均為P=0.00),NALP3高于正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉(均為P=0.00),Nod2三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.52,P=0.29)。3.免疫組織化學表明,三種模式受體在三組中均有表達,主要表達于上皮細胞、腺體上皮、炎性細胞(如漿細胞、嗜酸性粒細胞),變應性鼻炎黏膜組織Nod1表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.01,P=0.00),NALP3表達較較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2蛋白表達三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.14)。

參考文獻

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[2]Pattern‐recognition receptors in human eosinophils[J].Anne M?nssonKvarnhammar;Lars OlafCardell.Immunology,2012(1)

[3]Therapeutic Effects and Biomarkers in Sublingual Immunotherapy:A Review[J].Takashi Fujimura;;Yoshitaka Okamoto;;Masaru Taniguchi;;Nerin N.Bahceciler.Journal of Allergy,2012

[4]New Methods of Prevention and Treatment of Allergic Diseases[J].David El-Qutob Lopez.Recent Patents on InflammationandAllergy Drug Discovery,2012(1)

[5]張沈華.Nods樣模式識別受體在變應性鼻炎患者鼻黏膜中的表達及意義[D].南方醫(yī)科大學,2013.