研究背景

5-甲基胞嘧啶是核酸化學學科的熱點研究課題，它與許多生命活動息息相關，并且涉及到了很多疾病的病理學研究，因此被稱為"第五種堿基"[1]。作為DNA的正常組份，5-甲基胞嘧啶只占全部胞嘧啶的3%左右，在人類DNA中約占3.5～4.4%。在它的3'側常與鳥嘌呤為鄰，90%以上的5~C是以5'-5~mCG-3'的順序排在DNA中，因為5~mC與G相鄰，對側股按5'→3'方向也是5'-5~mCG-3'，故5~mCG在DNA中是對稱的[2]。

5-甲基胞嘧啶在化學修飾中扮演中至關重要的角色，早期的觀點認為這種修飾是靜態(tài)不變且只起到調控作用的。然而，近期的研究越來越表明5-甲基胞嘧啶在真核生物的一系列細胞內(nèi)反應中發(fā)揮著關鍵或必要的條件[3]。

合成方法

5-甲基胞嘧啶是一個非常重要的醫(yī)藥中間體，常用來制備抗病毒和抗腫瘤等藥物。關于該物質的合成，可以5-甲基脲嘧啶為原料，先與三氮唑反應制得中間體5-甲基-4-(1,2,4-三氮唑)-嘧啶-2-酮，接著該中間體在濃氨水的作用下水解生成?？偸章蕿?4.4%[4]。

檢測方法

文獻報道了一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學方法。該方法采用的兩種化合物分別為取代的苯磺酰氯胺鈉鹽和取代的苯磺酰溴胺鈉鹽，具體檢測步驟如下：先用取代的苯磺酰氯胺鈉鹽與帶熒光標記的DNA中的胞嘧啶反應，再用取代的苯磺酰溴胺鈉鹽與帶熒光標記的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應，然后用哌啶處理，通過比較DNA聚丙烯酰胺變性膠中兩個反應的DNA帶，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)[5]。

有關研究

分離研究

通過不同流動相，測定溫度，流速的對比，優(yōu)化分離煙葉總DNA中胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的高效液相色譜法?？緹煙熑~DNA采用CTAB法提取，高氯酸水解，用KOH調節(jié)pH到3~5，取上清液測定。色譜柱為Nuc leosil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)。優(yōu)化后測定條件為：流動相采用甲醇:5 mmol/L戊烷磺酸鈉(10:90,V/V)，流速0.7 ml/min，柱溫30℃，檢測波長273 nm，進樣量20μl。該方法簡化了流動相的配制，縮短了分離時間，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加標回收率分別為103.50%和96.67%，相對標準偏差為2.35%和2.80%。用該方法研究烤煙煙葉發(fā)育過程中總DNA胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量，效果良好，符合煙葉生長發(fā)育規(guī)律[6]。

水解反應研究

采用密度泛函理論方法在B3LYP/6-31G**水平下研究5-甲基胞嘧啶水解反應的微觀機理和勢能剖面。計算結果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反應有兩條反應途徑：(A)水分子進攻5-甲基胞嘧啶生成中間體IM1，然后氨分子充當橋生成終產(chǎn)物胸腺嘧啶；(B)水分子進攻5-甲基胞嘧啶首先生成四配位的中間體IM2，然后中間體分解成終產(chǎn)物胸腺嘧啶和氨分子。能量計算結果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反應決速步的活化能壘較高，在自發(fā)狀態(tài)下，5-甲基胞嘧啶的水解反應難于進行[7]。

復合物異構化研究

采用B3LYP/6-311+G(d)及MP2 /6-311+G(d)計算方法對5-甲基胞嘧啶與BH3所形成復合物及異構化反應進行研究，獲得了6種復合物及4個異構化過渡態(tài)。在考慮基組重疊誤 差校正基礎上，得到了結合能及變形能等信息，并用自然鍵軌道分析法討論了其相互作用情況。結果表明，BH3與5-甲基胞嘧啶中N(3)，O及N(4)相連 形成穩(wěn)定復合物a，b1，b2和c，其結合能分別為104.58，92.25，63.49和43.41 kJ·mol^-1。復合物a，b1，b2，c和d既可通過BH3與5-甲基胞嘧啶不同部位結合直接生成，也可通過BH3整體遷移實現(xiàn)相互轉化，甲基化對復 合物穩(wěn)定性及相互異構化能壘無明顯影響[8]。

參考文獻

[1]吳凡,周翔.基于連接酶鏈式反應檢測5-甲基胞嘧啶[C]//全國化學生物學學術會議.2017.

[2]蔣棟良.5-甲基胞嘧啶與化學致癌[J].國外醫(yī)學(分子生物學分冊), 1985(3).

[3]劉卓,潘攀.5-甲基胞嘧啶——高等生物的主要表觀遺傳標記[J].醫(yī)藥前沿 2018年8卷1期, 25-26頁, 2018, 8(1):25-26.DOI:10.3969/j.issn.2095-1752.2018.01.017.

[4]單紹軍,李心恬,黃善東,等.5-甲基胞嘧啶的合成[J].遼寧化工, 2010(6):2.DOI:10.3969/j.issn.1004-0935.2010.06.005.

[5]周翔,王天露,翁小成.一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學方法:CN201210427481.5[P].CN102912024A.

[6]賈峰,魏慶華,杜錚,等.烤煙煙葉胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分離條件的優(yōu)化[J].山東農(nóng)業(yè)科學, 2010(6):4.DOI:10.3969/j.issn.1001-4942.2010.06.029.

[7]張愛華 楊寶華 李琳.5-甲基胞嘧啶水解反應機理的理論研究[J].信陽師范學院學報(自然科學版), 2014(27):343.DOI:10.3969/j.issn.1003-0972.2014.03.008.

[8]靳玲俠,王文亮,吳東兵,等.5-甲基胞嘧啶-BH3復合物構型及異構化機理的理論研究[J].化學學報, 2007, 65(11):7.DOI:10.3321/j.issn:0567-7351.2007.11.003.