研究背景

5-甲基胞嘧啶是核酸化學(xué)學(xué)科的熱點(diǎn)研究課題，它與許多生命活動息息相關(guān)，并且涉及到了很多疾病的病理學(xué)研究，因此被稱為"第五種堿基"[1]。作為DNA的正常組份，5-甲基胞嘧啶只占全部胞嘧啶的3%左右，在人類DNA中約占3.5～4.4%。在它的3'側(cè)常與鳥嘌呤為鄰，90%以上的5~C是以5'-5~mCG-3'的順序排在DNA中，因為5~mC與G相鄰，對側(cè)股按5'→3'方向也是5'-5~mCG-3'，故5~mCG在DNA中是對稱的[2]。

5-甲基胞嘧啶在化學(xué)修飾中扮演中至關(guān)重要的角色，早期的觀點(diǎn)認(rèn)為這種修飾是靜態(tài)不變且只起到調(diào)控作用的。然而，近期的研究越來越表明5-甲基胞嘧啶在真核生物的一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵或必要的條件[3]。

合成方法

5-甲基胞嘧啶是一個非常重要的醫(yī)藥中間體，常用來制備抗病毒和抗腫瘤等藥物。關(guān)于該物質(zhì)的合成，可以5-甲基脲嘧啶為原料，先與三氮唑反應(yīng)制得中間體5-甲基-4-(1,2,4-三氮唑)-嘧啶-2-酮，接著該中間體在濃氨水的作用下水解生成。總收率為24.4%[4]。

檢測方法

文獻(xiàn)報道了一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法。該方法采用的兩種化合物分別為取代的苯磺酰氯胺鈉鹽和取代的苯磺酰溴胺鈉鹽，具體檢測步驟如下：先用取代的苯磺酰氯胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA中的胞嘧啶反應(yīng)，再用取代的苯磺酰溴胺鈉鹽與帶熒光標(biāo)記的DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應(yīng)，然后用哌啶處理，通過比較DNA聚丙烯酰胺變性膠中兩個反應(yīng)的DNA帶，可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶的位置和個數(shù)[5]。

有關(guān)研究

分離研究

通過不同流動相，測定溫度，流速的對比，優(yōu)化分離煙葉總DNA中胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的高效液相色譜法?？緹煙熑~DNA采用CTAB法提取，高氯酸水解，用KOH調(diào)節(jié)pH到3~5，取上清液測定。色譜柱為Nuc leosil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)。優(yōu)化后測定條件為：流動相采用甲醇:5 mmol/L戊烷磺酸鈉(10:90,V/V)，流速0.7 ml/min，柱溫30℃，檢測波長273 nm，進(jìn)樣量20μl。該方法簡化了流動相的配制，縮短了分離時間，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加標(biāo)回收率分別為103.50%和96.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.35%和2.80%。用該方法研究烤煙煙葉發(fā)育過程中總DNA胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量，效果良好，符合煙葉生長發(fā)育規(guī)律[6]。

水解反應(yīng)研究

采用密度泛函理論方法在B3LYP/6-31G**水平下研究5-甲基胞嘧啶水解反應(yīng)的微觀機(jī)理和勢能剖面。計算結(jié)果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反應(yīng)有兩條反應(yīng)途徑：(A)水分子進(jìn)攻5-甲基胞嘧啶生成中間體IM1，然后氨分子充當(dāng)橋生成終產(chǎn)物胸腺嘧啶；(B)水分子進(jìn)攻5-甲基胞嘧啶首先生成四配位的中間體IM2，然后中間體分解成終產(chǎn)物胸腺嘧啶和氨分子。能量計算結(jié)果表明，5-甲基胞嘧啶的水解反應(yīng)決速步的活化能壘較高，在自發(fā)狀態(tài)下，5-甲基胞嘧啶的水解反應(yīng)難于進(jìn)行[7]。

復(fù)合物異構(gòu)化研究

采用B3LYP/6-311+G(d)及MP2 /6-311+G(d)計算方法對5-甲基胞嘧啶與BH3所形成復(fù)合物及異構(gòu)化反應(yīng)進(jìn)行研究，獲得了6種復(fù)合物及4個異構(gòu)化過渡態(tài)。在考慮基組重疊誤 差校正基礎(chǔ)上，得到了結(jié)合能及變形能等信息，并用自然鍵軌道分析法討論了其相互作用情況。結(jié)果表明，BH3與5-甲基胞嘧啶中N(3)，O及N(4)相連 形成穩(wěn)定復(fù)合物a，b1，b2和c，其結(jié)合能分別為104.58，92.25，63.49和43.41 kJ·mol^-1。復(fù)合物a，b1，b2，c和d既可通過BH3與5-甲基胞嘧啶不同部位結(jié)合直接生成，也可通過BH3整體遷移實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化，甲基化對復(fù) 合物穩(wěn)定性及相互異構(gòu)化能壘無明顯影響[8]。

參考文獻(xiàn)

[1]吳凡,周翔.基于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測5-甲基胞嘧啶[C]//全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會議.2017.

[2]蔣棟良.5-甲基胞嘧啶與化學(xué)致癌[J].國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊), 1985(3).

[3]劉卓,潘攀.5-甲基胞嘧啶——高等生物的主要表觀遺傳標(biāo)記[J].醫(yī)藥前沿 2018年8卷1期, 25-26頁, 2018, 8(1):25-26.DOI:10.3969/j.issn.2095-1752.2018.01.017.

[4]單紹軍,李心恬,黃善東,等.5-甲基胞嘧啶的合成[J].遼寧化工, 2010(6):2.DOI:10.3969/j.issn.1004-0935.2010.06.005.

[5]周翔,王天露,翁小成.一種檢測DNA中5-甲基胞嘧啶的化學(xué)方法:CN201210427481.5[P].CN102912024A.

[6]賈峰,魏慶華,杜錚,等.烤煙煙葉胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分離條件的優(yōu)化[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(6):4.DOI:10.3969/j.issn.1001-4942.2010.06.029.

[7]張愛華 楊寶華 李琳.5-甲基胞嘧啶水解反應(yīng)機(jī)理的理論研究[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2014(27):343.DOI:10.3969/j.issn.1003-0972.2014.03.008.

[8]靳玲俠,王文亮,吳東兵,等.5-甲基胞嘧啶-BH3復(fù)合物構(gòu)型及異構(gòu)化機(jī)理的理論研究[J].化學(xué)學(xué)報, 2007, 65(11):7.DOI:10.3321/j.issn:0567-7351.2007.11.003.