背景^[1-3]

GAD1抗體是一種在WB、IHC、IF-Fro、IP、ELISA等實(shí)驗(yàn)中靶向結(jié)合GAD1的免疫蛋白。谷氨酸脫羧酶1(GAD1)，也稱(chēng)為GAD67，是一種通過(guò)催化抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的合成在神經(jīng)傳遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。GAD1利用吡哆醛5'-磷酸作為谷氨酸脫羧形成GABA的輔助因子，GABA是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性的重要神經(jīng)遞質(zhì)。GAD1平衡產(chǎn)生GABA對(duì)于維持神經(jīng)回路的抑制-興奮平衡至關(guān)重要，并且與神經(jīng)系統(tǒng)的各種生理和病理狀況有關(guān)。

GAD1抗體

GAD1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿(mǎn)tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（GAD1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(GAD1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

GAD1抗體可以用于SFPQ復(fù)合物及GAD1促進(jìn)腸道病毒復(fù)制的機(jī)制研究

探究SFPQ/NONO復(fù)合物促進(jìn)腸道病毒復(fù)制的作用機(jī)制。首先,使用SiRNA敲低SFPQ/NONO的表達(dá),發(fā)現(xiàn)EV-A71病毒基因組的復(fù)制、蛋白的翻譯及病毒滴度均受到了抑制,說(shuō)明了SFPQ/NONO有助于EV-A71的復(fù)制。隨后,通過(guò)免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn),EV-A71誘導(dǎo)SFPQ/NONO發(fā)生出核現(xiàn)象,并在細(xì)胞質(zhì)形成聚集性顆粒。通過(guò)病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)結(jié)合免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn),SFPQ/NONO感染EV-A71 2h能夠觀察到出核,而4h幾乎均位于胞質(zhì)中,且SFPQ和NONO共同存在該聚集性顆粒中。通過(guò)RNA pull down發(fā)現(xiàn)SFPQ/NONO與EV-A71的5'UTR的存在相互作用,且SFPQ可以促進(jìn)EV-A71 5'UTR介導(dǎo)的翻譯。

結(jié)果說(shuō)明,腸道病毒的翻譯依賴(lài)于感染后誘導(dǎo)出核的SFPQ/NONO復(fù)合物。最后,通過(guò)外源轉(zhuǎn)染EV-A71的3Cpro,發(fā)現(xiàn)3C對(duì)SFPQ存在切割,并且3C的切割條帶與病毒感染導(dǎo)致的切割條帶一致,而當(dāng)SFPQ的113位和/或257位氨基酸突變后,切割條帶消失。將SFPQ野生型、切割片段與EV-A71 5'UTR-Luc共轉(zhuǎn)發(fā)現(xiàn),SFPQ 114-707片段的促進(jìn)EV-A71的翻譯作用更強(qiáng)。以上結(jié)果說(shuō)明了腸道病毒對(duì)SFPQ的切割可以增強(qiáng)其輔助病毒翻譯的作用。在促進(jìn)病毒復(fù)制水平的宿主因子中,我們還發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶1(GAD1)可以促進(jìn)EV-A71、EV-D68、CV-A16和HRV16的復(fù)制。在HEK293T細(xì)胞中,經(jīng)GAD1抗體檢測(cè)過(guò)表達(dá)GAD1后,EV-D68的復(fù)制水平隨GAD1轉(zhuǎn)染量的增加而增強(qiáng)。將GAD1功能位點(diǎn)(405位賴(lài)氨酸)突變后,GAD1促進(jìn)EV-D68復(fù)制的作用消失。使用GAD1的抑制劑3-巰基丙酸(3-MPA)處理可以減弱GAD1促進(jìn)EV-D68復(fù)制的作用。這說(shuō)明GAD1促進(jìn)EV-D68復(fù)制的作用是酶活性依賴(lài)的。GAD1的產(chǎn)物GABA也可以促進(jìn)EV-D68的復(fù)制,說(shuō)明了GAD1是通過(guò)其產(chǎn)物GABA對(duì)EV-D68的復(fù)制起作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)EV-A71感染誘導(dǎo)核內(nèi)分子SFPQ/NONO出核形成聚集性顆粒,與EV-A71 5'UTR相互作用促進(jìn)病毒RNA的翻譯;EV-A71通過(guò)3Cpro對(duì)復(fù)合物中SFPQ進(jìn)行了切割,切割產(chǎn)物增強(qiáng)EV-A71 5'UTR介導(dǎo)的翻譯作用。并且神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)分子GAD1在體外具有促進(jìn)腸道病毒復(fù)制的作用。

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