背景[1-3]
人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒是一種用于定量檢測人血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中甲基化酶含量的實驗工具。以下是對該試劑盒的詳細介紹：
人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱：人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒
英文名稱：Human Methylase ELISA Kit
規(guī)格：通常有48T和96T兩種規(guī)格，分別代表可進行48次和96次檢測。
存儲條件：一般建議存儲于2-8℃的冷藏環(huán)境中，也有產(chǎn)品推薦在4°C密封陰涼處保存。長期不使用時，可存儲于-20℃。
保質(zhì)期：通常為6個月。
二、產(chǎn)品特點
高效、靈敏、特異：試劑盒采用高效、靈敏、特異的抗體，能夠準確檢測樣本中的甲基化酶含量。
適用多種樣本類型：適用于血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等多種標本類型。
操作簡便：試劑盒提供詳細的操作說明書，用戶只需按照說明書步驟操作即可完成實驗。
穩(wěn)定性好：試劑盒中的組分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制，確保實驗的穩(wěn)定性和重復性。
三、實驗原理
人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒采用雙抗體夾心法測定標本中甲基化酶的水平。具體步驟如下：
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μl，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。
四、注意事項
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出后應(yīng)在室溫平衡一段時間（如15-30分鐘）后方可使用。
濃洗滌液在稀釋時可能會有結(jié)晶析出，可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。
標本采集后應(yīng)盡早進行提取和實驗，如需保存，應(yīng)放置于-20℃或更低溫度，避免反復凍融。
實驗過程中應(yīng)注意無菌操作，避免交叉污染。
應(yīng)用[4][5]
人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒可以用于DNA甲基化酶在尼羅羅非魚性別分化和性腺發(fā)育中的功能研究
表觀遺傳研究不改變DNA序列下基因表達的可遺傳改變,DNA甲基化是表觀遺傳學研究的重要內(nèi)容,催化DNA發(fā)生甲基化的酶被稱為DNA甲基化酶（DNA methyltransferases,dnmts）。硬骨魚類特有的第三輪基因組復制增加了DNA甲基化酶家族成員數(shù)目,擁有1個維持DNA甲基化酶以及3-5個從頭DNA甲基化酶。已有的研究表明在魚類卵巢和精巢之間DNA甲基化水平存在巨大差異,在魚類性逆轉(zhuǎn)過程中,包括雌魚向雄魚性逆轉(zhuǎn)以及雄魚向雌魚性逆轉(zhuǎn),性別決定和分化關(guān)鍵基因的DNA甲基化水平以及一些DNA甲基化酶家族成員的表達發(fā)生顯著改變。這些結(jié)果暗示DNA甲基化酶在魚類性別決定和分化過程中可能發(fā)揮著重要作用。然而,目前對DNA甲基化酶在魚類性腺發(fā)育過程中的表達和功能鮮有報道。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是世界性的養(yǎng)殖魚類,擁有XX/XY性別決定系統(tǒng),其性別由遺傳和環(huán)境因素共同決定。羅非魚雄性比雌性生長快50%,性別決定和分化機制的解析有利于遺傳育種。
本研究采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）、人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）分析了DNA甲基化酶家族成員在尼羅羅非魚性腺中的表達模式,采用DNA甲基化酶抑制劑解析了DNA甲基化酶在性腺發(fā)育以及性別分化中的功能,構(gòu)建dnmt3aa和dnmt3ab突變系進一步揭示了其在性腺發(fā)育中的作用。
人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒主要研究結(jié)果如下:1、DNA甲基化酶家族成員在尼羅羅非魚性腺發(fā)育中的表達研究。尼羅羅非魚DNA甲基化酶家族有6個成員,包括一個維持甲基化酶dnmt1,以及5個從頭甲基化酶dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2。q RT-PCR分析顯示DNA甲基化酶家族成員在尼羅羅非魚性腺不同發(fā)育時期（5、30、60、90、120和180 days after hatching,dah）呈性二態(tài)性表達,dnmt1和dnmt3ba在卵巢中的表達顯著高于精巢,dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表達高于卵巢。人甲基化酶(Methylase)Elisa試劑盒及熒光原位雜交顯示,dnmt1、dnmt3aa、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2高表達于卵巢卵原細胞、I時相和II時相卵母細胞、顆粒細胞以及精巢精原細胞和精母細胞,dnmt3ab高表達于卵巢顆粒細胞以及精巢精原細胞和精母細胞。
參考文獻
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[3]Comprehensive analysis of genome‐wide DNA methylation and transcriptomics between ovary and testis in Monopterus albus[J].Chen Mei;Ruan Rui;Zhong Xuqing;Ye Huan;Yue Huamei;Li Zhong;Li Chuangju.Aquaculture Research,2021
[4]Potential role of DNA methylation of cyp19a1a promoter during sex change in protogynous orange-spotted grouper,Epinephelus coioides.[J].Guo ChunYang;Tseng PengWei;Hwang JiangShiou;Wu GuanChung;Chang ChingFong.General and comparative endocrinology,2021(prep)
[5]王飛龍.DNA甲基化酶在尼羅羅非魚性別分化和性腺發(fā)育中的功能研究[D].西南大學,2022.