背景技術(shù)
糠醛是一種重要的生物基平臺(tái)化合物(Green Chem.2010,12,539)，主要以農(nóng)業(yè)廢棄物如糧食作物殘?jiān)蚰静膹U物為原料制備得到。當(dāng)前，糠醛全球年產(chǎn)量約為28萬(wàn)噸(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。其中，我國(guó)為糠醛主要生產(chǎn)國(guó)，全球70％的糠醛是由我國(guó)生產(chǎn)的?？啡┓肿又泻腥┗头枷汶s環(huán)，易進(jìn)一步高值化轉(zhuǎn)化為各種高附加值化學(xué)品?？反际强啡┓肿又腥┗x擇性還原產(chǎn)物，在醫(yī)藥、高分子、食品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。據(jù)報(bào)道，約65％糠醛被用于生產(chǎn)糠醇?？反疾粌H可以用于合成生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)芯模的高性能樹脂、聚氨酯泡沫及聚酯等高分子材料，而且還是制備生物基燃料、四氫糠醇、抗?jié)兯幬锢啄崽娑〖跋闼鹊闹匾虚g體(Energy Environ.Sci.2016,9,1144；ACS SustainableChem.Eng.2015,3,1263)。
當(dāng)前，工業(yè)上糠醇主要是通過(guò)糠醛催化加氫制備得到，既可以在液相體系反應(yīng)得到，也可以通過(guò)氣相體系來(lái)實(shí)現(xiàn)；無(wú)論是何種反應(yīng)體系中，均以銅基催化劑為主，尤其是銅-鉻催化劑最為常用(ACS Catal.2016,6,7621)。然而，銅-鉻催化劑中的鉻具有高毒性，因此產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。盡管近年來(lái)糠醛化學(xué)催化加氫已取得了長(zhǎng)足的發(fā)展和進(jìn)步，但仍以金屬催化劑為主，并且需要高溫高壓，故化學(xué)法仍存在環(huán)境不友好、反應(yīng)條件苛刻、選擇性不佳、催化劑易失活等問(wèn)題(Energy Environ.Sci.2016,9,1144)。近年來(lái)，生物催化由于具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、環(huán)境友好等特點(diǎn)，無(wú)論是在學(xué)術(shù)界還是在工業(yè)界都受到了廣泛的關(guān)注。
然而，與化學(xué)法相比，生物催化糠醛還原合成糠醇研究仍處于起步階段，仍存在諸多問(wèn)題。此外，糠醛對(duì)微生物具有強(qiáng)的抑制和毒性作用(Bioresour.Technol.2000,74,25)，因此全細(xì)胞催化糠醛還原仍頗具挑戰(zhàn)。He等報(bào)道了一系列Escherichia coli基因工程重組菌，用于催化糠醛還原制備糠醇(Bioresour.Technol.2017,238,698；Bioresour.Technol.2017,245,841；Appl.Biochem.Biotechnol.2018,185,42；Bioresour.Technol.2018,262,52)。這些工程菌對(duì)糠醛的最高耐受度約為200mM，當(dāng)反應(yīng)體系中糠醛濃度超過(guò)該值時(shí)，糠醇的產(chǎn)率急劇下降。盡管重組菌E.coli CCZU-K14能較高效、高選擇性地催化200mM糠醛轉(zhuǎn)化為糠醇，但是該生物轉(zhuǎn)化需要添加過(guò)量的輔底物(300mM葡萄糖)及輔酶前提物(400mM木糖)方能順利進(jìn)行，這不僅大大限制了該工藝的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性，而且加大了后續(xù)產(chǎn)物分離純化的難度(Bioresour.Technol.2017,238,698)。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種高活性、高底物耐受性、易重復(fù)利用的固定化生物催化劑；并基于該固定化生物催化劑，提供一種簡(jiǎn)單、高效、且高選擇性合成糠醇的方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種糠醇的制備方法，將固定化季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103用于催化糠醛還原制備糠醇。
所述的制備方法，包括如下步驟：將固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細(xì)胞加入含有糠醛和葡萄糖的緩沖液中，進(jìn)行反應(yīng)，得到糠醇。
優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細(xì)胞濃度為20～60mg(細(xì)胞濕重)/mL緩沖液。
優(yōu)選地，所述糠醛濃度為50～250mM。
優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細(xì)胞濃度為30～60mg(細(xì)胞濕重)/mL緩沖液，所述糠醛濃度為50～200mM。
優(yōu)選地，所述葡萄糖與糠醛的摩爾比為7:15～1:1。
優(yōu)選地，所述緩沖液為乙酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，所述緩沖液的pH介于5～9。
優(yōu)選地，所述反應(yīng)條件為：溫度為25～45℃，時(shí)間為2～24h，攪拌速度為200r/min。
優(yōu)選地，所述固定化季也蒙畢赤酵母SC1103的制備方法為：將收集的固定化季也蒙畢赤酵母SC1103細(xì)胞按200～600mg/mL(細(xì)胞濕重)的濃度與海藻酸鈉溶液混合均勻；然后，用無(wú)菌注射器逐滴滴入CaCl2溶液中靜置固化，最后用Tris-HCl緩沖液洗滌即可。
優(yōu)選地，所述季也蒙畢赤酵母SC1103經(jīng)過(guò)濃度梯度馴化，所述馴化方法為：將季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入含5mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將該菌懸液接入新鮮的含5mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h；隨后，以2％的接種量將上述菌懸液先后接入含10及15mM 5-羥甲基糠醛的液體培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行馴化；馴化后的菌株保藏于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面；所述液體培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖，其組成為1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。
所述酵母活化方法為：將馴化后的季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將該菌懸液接入新鮮酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h，收集菌體細(xì)胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)：
1)利用固定化細(xì)胞作為催化劑，不僅能克服了化學(xué)催化劑環(huán)境不友好的缺點(diǎn)，而且在反應(yīng)結(jié)束后可以通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾回收生物催化劑，既可實(shí)現(xiàn)催化劑的重復(fù)利用，又易于產(chǎn)物的分離純化。
2)本發(fā)明的固定化生物催化劑對(duì)底物具有高耐受性，能高效、高選擇性催化高濃度底物還原合成目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)物時(shí)空收率高。
3)本發(fā)明反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單，易控、條件溫和，活潑的糠醛在反應(yīng)過(guò)程中不易發(fā)生副反應(yīng)，不僅提高產(chǎn)品品質(zhì)高、降低了能耗，而且有利于簡(jiǎn)化后續(xù)目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化工藝。
本發(fā)明所用季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)SC1103，于2016年3月31日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)：CCTCC NO.M 2016144，該菌株已在公開號(hào)為CN106520580A的專利中公開，屬于現(xiàn)有技術(shù)。
具體實(shí)施方式
通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不局限于實(shí)施例。
季也蒙畢赤酵母SC1103馴化與活化：季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入含5mM HMF的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基(1％酵母膏，2％蛋白胨及2％葡萄糖)中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將上述菌懸液接入新鮮的含5mM HMF的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h。隨后，以2％的接種量將上述菌懸液先后接入含10及15mM5-羥甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，采用類似的步驟分別進(jìn)行馴化。將上述馴化后的季也蒙畢赤酵母SC1103菌種接入YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以2％的接種量將上述菌懸液接入新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)12h，收集菌體細(xì)胞。