背景^[1-3]

A-431人表皮癌細(xì)胞是一種人表皮樣癌細(xì)胞系，源自一名85歲患有表皮樣癌的女性的表皮。這種細(xì)胞系由D.J.Giard等人建立，并廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，特別是在癌癥生物學(xué)、免疫腫瘤學(xué)和毒理學(xué)研究方面。

A-431細(xì)胞具有上皮形態(tài)，并表現(xiàn)出貼壁生長的特性。這些細(xì)胞在培養(yǎng)中形成了細(xì)胞團(tuán)簇。它們是超三倍體人細(xì)胞株，模態(tài)染色體數(shù)為74，約在36%的細(xì)胞中存在。此外，A-431細(xì)胞過度表達(dá)表皮生長因子受體（EGFR），因此，它們也被用作研究細(xì)胞周期和癌癥相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路的有價(jià)值的體外模型。

在實(shí)驗(yàn)中，A-431細(xì)胞在抗胸腺細(xì)胞球蛋白、血清處理的NIH瑞士小鼠中可以形成類似于惡性黑素瘤快速增長的皮下腫瘤，而在普通成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層和瓊脂上則可以形成克隆。這些特性使得A-431細(xì)胞成為3D細(xì)胞培養(yǎng)、高通量篩選以及癌癥研究的理想選擇。

A-431人表皮癌細(xì)胞

A-431人表皮癌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇A-431人表皮癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)A-431人表皮癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)A-431人表皮癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

A-431人表皮癌細(xì)胞可以用于姜黃素對皮膚鱗狀細(xì)胞癌A-431人表皮癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂等重要作用,它是一種從自然界廣泛存在的姜黃的根莖中提取的天然活性酚類色素。目前研究顯示,姜黃素能抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖并誘導(dǎo)其凋亡,其抗腫瘤機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn),但其是否具有抑制皮膚癌細(xì)胞生長的作用尚不明確,這方面的研究還較少。

研究姜黃素對A-431人表皮癌細(xì)胞生長、增殖和凋亡的影響,探討姜黃素抗人表皮鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)制,為臨床皮膚癌的治療提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

方法1.采用MTT法檢測不同時(shí)間不同濃度姜黃素加藥對A-431人表皮癌細(xì)胞生長增殖的影響：空白對照、低、中、高四個(gè)濃度(O、20、40、80 umol/l)的姜黃素分別加藥A-431人表皮癌細(xì)胞三個(gè)時(shí)間點(diǎn)后(24 h、48 h、72 h),MTT比色法檢測姜黃素對A-431人表皮癌細(xì)胞增殖活力的影響。

2. 檢測姜黃素誘導(dǎo)A-431人表皮癌細(xì)胞凋亡的作用：倒置顯微鏡觀察空白對照組和加藥姜黃素組A-431人表皮癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、生長變化情況；單細(xì)胞凝膠電泳法分析不同濃度不同時(shí)間姜黃素處理A-431人表皮癌細(xì)胞DNA的受損情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測姜黃素處理對A-431人表皮癌細(xì)胞凋亡率的影響。

3. 探討姜黃索誘導(dǎo)A-431人表皮癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：Western blot法檢測姜黃素對A-431人表皮癌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。

結(jié)果1.姜黃素可以明顯的抑制A-431人表皮癌細(xì)胞生長增殖,呈劑量依賴性,隨著姜黃素藥物濃度的增高和作用時(shí)間的增長,抑制作用越來越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,吸光度值和抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05)。

2. 姜黃素處理后,光鏡下部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)改變；單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示隨著姜黃素加藥濃度的增高和作用時(shí)間的增長,A-431人表皮癌細(xì)胞DNA損傷增加；流式細(xì)胞儀器檢測結(jié)果顯示,隨著姜黃素加藥濃度的增高和作用時(shí)間的增長,人表皮鱗狀細(xì)胞癌A431的細(xì)胞凋亡率也上升。

3. Western blot結(jié)果顯示,隨著姜黃素加藥濃度的升高和時(shí)間的增長,與對照相比,A-431人表皮癌細(xì)胞的Caspase-3蛋白表達(dá)水平也有不同程度的升高。

結(jié)論姜黃素具有抑制A-431人表皮癌細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡的作用,姜黃素加藥后,A-431人表皮癌細(xì)胞DNA的損傷及Caspase-3蛋白表達(dá)的上調(diào)可能參與其凋亡過程。

參考文獻(xiàn)

[1]Cytotoxicity of curcumin silica nanoparticle complexes conjugated with hyaluronic acid on colon cancer cells[J].Surya Prakash Singh;;Mrinalini Sharma;;Pradeep Kumar Gupta.International Journal of Biological Macromolecules,2015

[2]Large solitary fibrous tumor of the oral cavity—Report of a case[J].Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira;;Assis Filipe Medeiros Albuquerque;;Matheus Dantas de Araújo Barreto;;Cassiano Francisco Weege Nonaka;;JoséSandro Pereira da Silva;;Adriano Rocha Germano;;Lélia Maria Guedes Queiroz.Pathology-Research and Practice,2014

[3]Curcumin suppresses tumor necrosis factor?α?induced matrix metalloproteinase?2expression and activity in rat vascular smooth muscle cells via the NF?κB pathway[J].Yi Zhong;;Wenyan Yu;;Jian Feng;;Zhongcai Fan;;Jiafu Li.Experimental and Therapeutic Medicine,2014(6)

[4]Antitumor and Antiangiogenic Activities of Curcumin in Cervical Cancer Xenografts in Nude Mice[J].Pornphrom Yoysungnoen-Chintana;;Parvapan Bhattarakosol;;Suthiluk Patumraj;;Kota V.Ramana.BioMed Research International,2014

[5]翟立廣.姜黃素對皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,2016.