背景^[1-3]

WESTERN封閉液也稱(chēng)為Western Blocking Buffer，是蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)中用于封閉轉(zhuǎn)移了蛋白樣品的PVDF膜或NC膜的一種試劑。其主要目的是減小后續(xù)的一抗或二抗與膜的非特異性結(jié)合，從而降低背景著色，增強(qiáng)信噪比。

WESTERN封閉液的主要成分通常包括TBS、BSA（牛血清白蛋白）和防腐劑等。其中，BSA經(jīng)過(guò)優(yōu)化選擇，能有效封閉膜上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)減少后續(xù)抗體的非特異性結(jié)合。除了使用含有BSA的封閉液外，還有一些實(shí)驗(yàn)會(huì)使用含脫脂奶粉、明膠或酪蛋白的封閉液，這些成分也具有一定的封閉效果。

WESTERN封閉液的使用通常是在轉(zhuǎn)膜和洗滌步驟之后進(jìn)行。封閉的時(shí)間和溫度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行調(diào)整。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以選擇在4℃條件下封閉過(guò)夜。此外，WESTERN封閉液應(yīng)妥善保存，避免室溫放置過(guò)久或反復(fù)凍融，以免導(dǎo)致蛋白降解和活性喪失。

WESTERN封閉液

Western封閉液是用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)重要組分，它的主要作用是減少非特異性結(jié)合，提高抗體與抗原結(jié)合的特異性。

Western Blot是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，通過(guò)聚丙烯酰胺電泳將蛋白樣本按分子量大小分離后轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后利用一抗和二抗對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)。在這個(gè)過(guò)程中，封閉液的應(yīng)用是一個(gè)關(guān)鍵步驟，它能夠幫助防止抗體在膜上非特異性地結(jié)合，這種非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)增強(qiáng)，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。正確的封閉液選擇對(duì)于Western Blot實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。

此外，還有一些Western封閉液，它們被設(shè)計(jì)用于Western Blot中轉(zhuǎn)移了蛋白樣品的PVDF膜或NC膜的封閉。這些封閉液可以有效減小后續(xù)的一抗或二抗和膜的非特異性結(jié)合，從而提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度和特異性。

在選擇Western封閉液時(shí)，需要考慮實(shí)驗(yàn)的具體需求，比如膜的類(lèi)型、樣品的特性以及所需的實(shí)驗(yàn)靈敏度等。使用封閉液時(shí)，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

應(yīng)用^[4][5]

WESTERN封閉液可以用于利鈉肽受體C在糖尿病性心肌病發(fā)病中的作用和分子機(jī)制研究

細(xì)胞提取和處理實(shí)驗(yàn)中采用組織消化和差速貼壁法提取新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CM)培養(yǎng)在含8%馬血清和5%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CF)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。分別給予正常糖(normalglucose,NG)組和高糖(highglucose,HG)組的細(xì)胞終濃度為5.5 mM和33.3 mM的葡萄糖刺激,并給予高滲(high osmotic,HO)組細(xì)胞終濃度為33.3 mM的甘露醇刺激。

細(xì)胞主要處理如下:(1)分別給予CF NG、HG和HO刺激并收集細(xì)胞;(2)分別給予CF對(duì)照小干擾RNA(si-NC)和NPRC小干擾RNA(si-NPRC)轉(zhuǎn)染,隨后給予NG和HG刺激,收集細(xì)胞;(3)分別給予CM si-NC和si-NPRC轉(zhuǎn)染,隨后給予NG和HG刺激,然后用不同處理的CM上清處理CF,收集細(xì)胞;(4)分別給予CF si-NC、si-NPRC、si-NPRC+si-TGIF1轉(zhuǎn)染,隨后給予HG刺激,收集細(xì)胞;(5)分別給予CF對(duì)照腺病毒(Ad-GFP)、ANP過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-ANP)、BNP過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-BNP)和CNP過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-CNP)轉(zhuǎn)染并收集細(xì)胞;(6)給予CF cAMP/PKA的激活劑forskolin和抑制劑H89處理并收集細(xì)胞;(7)給予CF cGMP/PKG的激活劑8-br-cGMP和抑制劑KT5823處理并收集細(xì)胞;7.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)對(duì)不同處理的細(xì)胞爬片行4%多聚甲醛固定、0.1%Triton X-100通透、5%BSA封閉和一抗過(guò)夜孵育,次日清洗后孵育二抗,并滴加DAPI染核,應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)并保存。

細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后,向細(xì)胞培養(yǎng)基中以1:2500的比例滴加EdU溶液,孵育12小時(shí)后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、染色處理,檢測(cè)熒光信號(hào)并保存。另外,向處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基中以1:10的比例加入CCK-8溶液,孵育4小時(shí)后,于酶標(biāo)儀上讀取450nm處的吸光度(OD值)。免疫共沉淀(CO-IP)實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后,用裂解液裂解細(xì)胞,分別加入cPML的抗體和對(duì)照小鼠IgG孵育1小時(shí),然后加入瓊脂糖珠孵育過(guò)夜。次日用裂解液清洗瓊脂糖珠,隨后進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)利用裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后應(yīng)用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上。膜經(jīng)WESTERN封閉液封閉封閉后過(guò)夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白信號(hào)。

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白分離提取對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后,利用胞漿和胞核提取緩沖液分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白并行Western blot檢測(cè)。細(xì)胞cAMP和cGMP水平檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)處理后,應(yīng)用Cyclic AMP/GMP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞cAMP和cGMP水平,并在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的OD值。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序細(xì)胞經(jīng)處理后,用Trizol溶液反復(fù)吹打裂解細(xì)胞,將裂解液凍存于-80℃后,送往上海鯨舟基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)提取細(xì)胞總RNA,測(cè)量濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR獲取細(xì)胞中NPRA、NPRB、NPRC、TGIF1基因的Ct值,以2-ΔΔCt公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)利用蛋白提取試劑盒提取小鼠心臟組織蛋白,或利用裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后應(yīng)用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上。膜經(jīng)WESTERN封閉液封閉后過(guò)夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白信號(hào)。

參考文獻(xiàn)

[1]IDF diabetes Atlas:Global,regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045.[J].Sun Hong;Saeedi Pouya;Karuranga Suvi;Pinkepank Moritz;Ogurtsova Katherine;Duncan Bruce B;Stein Caroline;Basit Abdul;Chan Juliana C N;Mbanya Jean Claude;Pavkov Meda E;Ramachandaran Ambady;Wild Sarah H;James Steven;Herman William H;Zhang Ping;Bommer Christian;Kuo Shihchen;Boyko Edward J;Magliano Dianna J.Diabetes research and clinical practice,2021

[2]Heart failure in diabetes.[J].Jankauskas Stanislovas S;Kansakar Urna;Varzideh Fahimeh;Wilson Scott;Mone Pasquale;Lombardi Angela;Gambardella Jessica;Santulli Gaetano.Metabolism:clinical and experimental,2021

[3]2021 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure.[J].McDonagh Theresa A;Metra Marco;Adamo Marianna;Gardner Roy S;Baumbach Andreas;B?hm Michael;Burri Haran;Butler Javed;?elutkien?Jelena;Chioncel Ovidiu;Cleland John G F;Coats Andrew J S;CrespoLeiro Maria G;Farmakis Dimitrios;Gilard Martine;Heymans Stephane;Hoes Arno W;Jaarsma Tiny;Jankowska Ewa A;Lainscak Mitja;Lam Carolyn S P;Lyon Alexander R;McMurray John J V;Mebazaa Alex;Mindham Richard;Muneretto Claudio;Francesco Piepoli Massimo;Price Susanna;Rosano Giuseppe M C;Ruschitzka Frank;Kathrine Skibelund Anne.European heart journal,2021

[4]PSPC1 is a new contextual determinant of aberrant subcellular translocation of oncogenes in tumor progression.[J].Lang YawDong;Jou YuhShan.Journal of biomedical science,2021

[5]孟霖霖.利鈉肽受體C在糖尿病性心肌病發(fā)病中的作用和分子機(jī)制研究[D].山東大學(xué),2024.