背景^[1-7]

GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒將目標(biāo)蛋白與GST融合表達(dá)，然后利用固定化的谷胱甘肽進(jìn)行純化，是比較經(jīng)典的純化路線(xiàn)。簡(jiǎn)單，快捷，純度高。GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒將親合層析技術(shù)與離心柱技術(shù)相結(jié)合，提供了一種快速簡(jiǎn)便的融合蛋白純化途徑。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是基因工程重組蛋白設(shè)計(jì)和表達(dá)過(guò)程中一種常用的融合標(biāo)簽。重組蛋白與GST融合后,不僅穩(wěn)定性提高、可溶性增強(qiáng),而且為下游的分離純化帶來(lái)了極大地方便。

GST分子量約為26 kDa,與還原型谷胱甘肽（GSH）有極強(qiáng)的親和力,因此可以利用固定化的GSH實(shí)現(xiàn)對(duì)GST融合蛋白的一步親和純化。GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）能特異的與谷胱甘肽結(jié)合，表現(xiàn)為酶和底物的作用原理，從而利用這個(gè)原理，將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合，從而純化出目標(biāo)蛋白，再用特異性的酶將GST標(biāo)簽切除從而得到天然蛋白。GST，即谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，與目的蛋白融合表達(dá)后，被稱(chēng)為GST標(biāo)簽重組蛋白、GST標(biāo)簽蛋白或GST融合蛋白。

GST標(biāo)簽重組蛋白可以通過(guò)GST特異性地結(jié)合到GST-tag Purification Resin，而其它蛋白則不能被結(jié)合，含GST標(biāo)簽的重組蛋白可被過(guò)量的還原型谷胱甘肽(GSH)溶液洗脫，從而實(shí)現(xiàn)GST標(biāo)簽蛋白的分離和純化。由于純化過(guò)程始終保持在溫和的非變性條件下，得到的目的蛋白可以保持其自身的生物學(xué)活性，因此可以用于常規(guī)的結(jié)構(gòu)和功能研究、抗體制備、以及蛋白與蛋白相互作用、蛋白與核酸相互作用等方面的研究。

劑盒中的BGST-tag Purification Resin采用了一種高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質(zhì)，并使用了進(jìn)一步優(yōu)化的接臂和GSH偶聯(lián)技術(shù)，可以高容量、高特異性地結(jié)合GST標(biāo)簽重組蛋白。和目前市售的大多數(shù)同類(lèi)產(chǎn)品相比，非特異性蛋白結(jié)合更低，耐受壓力更強(qiáng)，GSH的偶聯(lián)更加穩(wěn)定。GST-tag Purification Resin凝膠的顆粒直徑為45-165μm?？赡褪艿膲毫?.025MPa，約合5.8psi。

采用固定流速進(jìn)行蛋白純化時(shí)的推薦流速為0.5ml/min。GST-tag Purification Resin儲(chǔ)存在20%乙醇中，10ml總體積中5ml為凝膠，5ml為液體。使用時(shí)宜把凝膠充分重懸后再吸取。GST-tag Purification Resin對(duì)含GST標(biāo)簽重組蛋白的結(jié)合容量大，其對(duì)GST結(jié)合量為5-6mg蛋白/毫升凝膠，與國(guó)際知名品牌的同類(lèi)產(chǎn)品結(jié)合容量相當(dāng)。

實(shí)際使用時(shí)的結(jié)合量取決于待純化的GST標(biāo)簽重組蛋白的分子量大小，分子量越大則結(jié)合容量越大，分子量越小則結(jié)合容量越小。對(duì)于目的蛋白分子量為50kD的GST標(biāo)簽重組蛋白，每毫升凝膠的實(shí)際純化量約為8-12mg，對(duì)于目的蛋白分子量為100kD的GST標(biāo)簽重組蛋白，每毫升凝膠的實(shí)際純化量約為12-18mg。但對(duì)于分子量相同的蛋白，也會(huì)因?yàn)榈鞍妆旧硖匦缘牟煌?，結(jié)合的容量也會(huì)有所不同。

特點(diǎn):

1.用于分離純化帶有GST標(biāo)簽的可溶性重組蛋白，溶解于高濃度變性劑的包涵體蛋白不能用這種介質(zhì)純化；

2.特異性好、與GST融合蛋白親和力高，從細(xì)菌破碎液中經(jīng)一步親和純化即可得到純度超過(guò)95%的目標(biāo)蛋白；

3.結(jié)合在介質(zhì)上的GST融合蛋白，可被溶液中高濃度的還原型谷胱甘肽（GSH）（33 mM）競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。對(duì)不同的GST融合蛋白來(lái)說(shuō)，無(wú)需摸索的GSH洗脫濃度，使介質(zhì)的使用更加簡(jiǎn)單；

4.可再生，并反復(fù)使用。

應(yīng)用^[8]

GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒可用于帶有GST標(biāo)簽的蛋白純化：

用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組表達(dá)質(zhì)粒Lpp20/pGEX-4T-1在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達(dá),收集菌體并采用反復(fù)凍融、溶菌酶裂解及超聲破菌3種細(xì)胞破碎方法,表達(dá)產(chǎn)物在谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂4B柱上純化,利用凝血酶切除GST標(biāo)簽,用鼠抗Lpp20單克隆抗體進(jìn)行純化產(chǎn)物western blot鑒定。

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