背景^[1-3]

C-28/I2人正常軟骨細胞系是一種來源于人類正常軟骨組織的細胞系。這些細胞在實驗室條件下可以進行培養(yǎng)和研究，以深入了解人正常軟骨細胞的生物學(xué)特性、分化機制以及與軟骨相關(guān)疾病的關(guān)系。

C-28/I2人正常軟骨細胞系的研究對于理解軟骨細胞的生長、分化、代謝以及與軟骨相關(guān)疾病的發(fā)病機制具有重要意義。通過對這些細胞的研究，科學(xué)家們可以探索軟骨細胞的分化調(diào)控機制、骨關(guān)節(jié)炎等軟骨相關(guān)疾病的發(fā)病機制，以及尋找新的治療靶點和藥物。

在實驗室中，C-28/I2人正常軟骨細胞系通常通過細胞培養(yǎng)技術(shù)進行培養(yǎng)和繁殖?？茖W(xué)家們使用特定的培養(yǎng)基和條件，模擬體內(nèi)的環(huán)境，以促進細胞的生長和分化。通過這些細胞培養(yǎng)實驗，可以觀察細胞的形態(tài)、生長速度、分化狀態(tài)等指標，以評估軟骨細胞的生物學(xué)特性和治療效果。

C-28/I2人正常軟骨細胞系

C-28/I2人正常軟骨細胞系細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇C-28/I2人正常軟骨細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)C-28/I2人正常軟骨細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)C-28/I2人正常軟骨細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

C-28/I2人正常軟骨細胞系可以用于氟通過促進Ihh/PTHrP信號通路下游HDAC4核表達抑制C-28/I2人正常軟骨細胞系增殖分化

通過對C-28/I2人正常軟骨細胞系進行染氟處理,檢測軟骨細胞增殖、分化標志因子(Col2a1、Sox9和Col10a1)以及Ihh/PTHrP信號通路相關(guān)因子(PTHrP、Ihh、Mef2C、Runx2和p38)的表達,并且檢測HDAC4在軟骨細胞中的表達及磷酸化水平,探討氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系增殖、分化的影響和Ihh/PTHrP信號通路及下游HDAC4等相關(guān)因子在其中的調(diào)控作用,進一步闡明氟損傷軟骨發(fā)育的機制。

實驗方法:本研究選取C-28/I2人正常軟骨細胞系,用不同濃度NaF處理不同時間,通過CCK-8法選取最佳染氟劑量和時間。采用阿利新藍染色檢測軟骨細胞蛋白多糖的表達,并采用實時熒光定量PCR檢測軟骨細胞中ACAN mRNA的表達;采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測軟骨細胞增殖標志因子Col2a1和Sox9以及分化標志因子Coll0a1的mRNA和蛋白表達水平;采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Ihh/PTHrP信號通路相關(guān)因子PTHrP、Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表達水平;采用免疫熒光法檢測軟骨細胞中HDAC4的表達,并用免疫印跡法檢測HDAC4的磷酸化水平;采用免疫印跡法檢測p38的磷酸化水平。

結(jié)果:1、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系活力的影響:經(jīng)過10-6 mol/L、10-5mol/L和10-4 mol/LNaF處理C-28/I2人正常軟骨細胞系72h后,細胞活力與對照組相比無明顯改變,而10-3 mol/L NaF處理72h后細胞活力與對照組相比明顯降低,差異具有顯著性(P<0.05)。與對照組相比,用10-3 mol/L NaF處理C-28/I2人正常軟骨細胞系24h,細胞活力無明顯改變,但處理48h和72h后C28/I2細胞活力均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.05)。因此,后續(xù)實驗采用10-3 mol/LNaF處理C-28/I2人正常軟骨細胞系48h和72h。

2、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系蛋白多糖表達的影響:NaF組阿利新藍染色較對照組淺,定量結(jié)果顯示C-28/I2人正常軟骨細胞系中蛋白多糖表達減少,差異具有顯著性(P<0.05);NaF組軟骨細胞中ACAN mRNA表達較對照組明顯降低,差異具有顯著性(P<0.05)。

3、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系增殖和分化標志因子表達的影響:NaF組C-28/I2人正常軟骨細胞系增殖標志因子Col2a1 mRNA和蛋白表達均較對照組降低,差異具有顯著性(P<0.05);NaF組Sox9mRNA表達較對照組有下降趨勢,但無顯著性(P>0.05),Sox9蛋白表達明顯下降,差異具有顯著性(P<0.05);與對照組相比,NaF組軟骨細胞分化標志因子Coll0a1 mRNA無明顯改變,但蛋白表達水平降低,差異具有顯著性(P<0.05)。

4、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系Ihh/PTHrP負反饋環(huán)及下游信號分子的影響:與對照組相比,NaF組PTHrP mRNA和蛋白表達水平均明顯升高,差異具有顯著性(P<0.05),NaF組Ihh、Mef2C和Runx2的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.05)。

5、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系HDAC4蛋白表達的影響:免疫熒光結(jié)果表明,HDAC4主要表達在C-28/I2人正常軟骨細胞系細胞核中,細胞質(zhì)中有少量表達。NaF組軟骨細胞細胞核中HDAC4熒光強度相較于對照組明顯增加;NaF組C-28/I2人正常軟骨細胞系HDAC4磷酸化水平下降,p-HDAC4/HDAC4較對照組明顯降低,差異有顯著性(P<0.05)。

6、氟對C-28/I2人正常軟骨細胞系p38蛋白表達的影響:與對照組相比,NaF組p38蛋白磷酸化水平下降,p-p38/p38明顯降低,差異具有顯著性(P<0.05)。

參考文獻

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