背景^[1-3]

NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系是一種用于研究人惡性胸膜間皮瘤的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系是通過將惡性胸膜間皮瘤的腫瘤組織進(jìn)行體外培養(yǎng)而獲得的。

NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系可以用于研究胸膜間皮瘤的生物學(xué)特性、藥物篩選和化療藥物敏感性等方面的研究。這種細(xì)胞系還可以用于評(píng)估治療效果和開發(fā)新的治療策略。

NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系

NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系可以用于ONYX-015與Nutlin-3a對(duì)惡性間皮瘤細(xì)胞的作用研究

通過ONYX-015與Nutlin-3a在間質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用效果,ONYX-015表達(dá)p53基因,Nutlin-3a減少p53降解,檢測ONYX-015和Nutlin-3a的抗腫瘤效果,抑制細(xì)胞生長能力。結(jié)果顯示,ONYX-015提高p53表達(dá)水平,促進(jìn)p53磷酸化,同時(shí),Nutlin-3a特異性的與惡性間皮瘤中MDM2蛋白的結(jié)合,蛋白酶體功能受到抑制,p53降解減少,導(dǎo)致p53蛋白堆積,同時(shí)p21表達(dá)升高并且磷酸化Rb的表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡蛋白酶3(cleaved caspase-3)和細(xì)胞凋亡蛋白酶8(cleaved caspase-8)表達(dá)升高,激活p53介導(dǎo)的外源性凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。

方法:本實(shí)驗(yàn)使用體外培養(yǎng)惡性間皮瘤:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細(xì)胞株。以MTT實(shí)驗(yàn),通過MTT結(jié)果計(jì)算50%抑制藥物濃度值(IC50),判斷對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞對(duì)選擇性腺病毒(選用ONYX-015)及MDM2蛋白抑制劑(選用Nutlin-3a)在以上惡性間皮瘤細(xì)胞系的抑制敏感性。并使用Trypan blue dye exclusion assay檢測ONYX-015對(duì)以上惡性間皮瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長的抑制效果。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期,分析ONYX-015對(duì)Sub-G1期為主的細(xì)胞周期的影響。使用Western blot方法分析ONYX-015及Nutlin-3a使用所導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)通路變化。最后,運(yùn)用細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)來檢測,ONYX-015和Nutlin-3a聯(lián)合用藥相比于單獨(dú)用藥的藥效區(qū)別,將產(chǎn)生協(xié)同作用還是拮抗作用。β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因腺病毒(Ad/Lac Z)作為細(xì)胞毒性低的腺病毒,在實(shí)驗(yàn)過程中作為陰性對(duì)照。

結(jié)果:1 MTT的分析結(jié)果人體惡性間皮瘤細(xì)胞系:MSTO-211H,NCI-H28,EHMES-10,NCI-H2052,EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B經(jīng)過不同濃度的ONYX-015和處理對(duì)細(xì)胞活性的影響,Ad-Lac Z作為陰性對(duì)照。CI50結(jié)果顯示MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系、EHMES-10細(xì)胞較為敏感。同時(shí)結(jié)果提示MSTO-211H細(xì)胞對(duì)ONYX-015最為敏感,其次是NCI-H28、EHMES-10細(xì)胞對(duì)ONYX-015較為敏感。之后是NCI-H2052細(xì)胞,而EHMES-1,NCI-2452及JMN-1B細(xì)胞對(duì)ONYX-015不敏感。原因?yàn)镋HMES-1,NCI-2452及JMN-1B為變異性p53細(xì)胞株,MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系、EHMES-10為野生型p53細(xì)胞株。說明變異型p53細(xì)胞系普遍對(duì)ONYX-015不敏感。野生型p53細(xì)胞MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052人惡性胸膜間皮瘤貼壁細(xì)胞系、EHMES-10經(jīng)過Nutlin-3a處理,MSTO-211H、NCI-H28、EHMES-10細(xì)胞較為敏感,Nutlin-3a抑制了MSTO-211H、NCI-H28細(xì)胞的惡性間皮瘤細(xì)胞的生長。根據(jù)MTT計(jì)算的IC50結(jié)果提示NCI-H28細(xì)胞對(duì)Nutlin-3a最為敏感,其次是MSTO-211H細(xì)胞,之后是EHMES-10細(xì)胞,NCI-H2052細(xì)胞對(duì)Nutlin-3a敏感性不佳。

2臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(Trypan blue dye exclusion assay)Trypan blue dye exclusion assay結(jié)果顯示:ONYX-015抑制了MSTO-211H、NCI-H28細(xì)胞的惡性間皮瘤細(xì)胞的生長。而Ad/Lac Z對(duì)照組生長情況與空白對(duì)照組類似,未受到明顯抑制。

3流式細(xì)胞周期的分析結(jié)果分別使用ONYX-015和Ad/Lac Z感染惡性間皮瘤細(xì)胞NCI-H28和MSTO-211H,Ad/Lac Z作為陰性對(duì)照。ONYX-015導(dǎo)致NCI-H28細(xì)胞周期sub-G1期明顯比例提升,以及細(xì)胞周期G2/M期比例提升,S期和G0/G1期比例減低。MSTO-211H細(xì)胞表現(xiàn)為Sub-G1比例,以及G0/G1期比例提升,G2/M期與S期比例變化幅度不明顯。兩種細(xì)胞對(duì)比,NCI-H28細(xì)胞與MSTO-211H細(xì)胞Sub-G1的比例相比,NCI-H28細(xì)胞的Sub-G1增加的更加明顯,說明NCI-H28細(xì)胞對(duì)ONYX-015更加敏感性。同時(shí),陰性對(duì)照Ad/Lac Z組的結(jié)果與空白對(duì)照組不存在明顯差異。

參考文獻(xiàn)

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