背景技術(shù)

醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2（GHRP）是Momany等人于1984年設(shè)計(jì)合成的一個(gè)含有D型氨基酸的六肽（His-D-Try-Ala-Try-D-Phe-Lys-NH₂），它有較高的促進(jìn)垂體分泌生長(zhǎng)激素GH的活力，卻不影響其他垂體激素如TSH、LH、FSH的分泌，而且沒(méi)有種屬特異性，可廣譜地促進(jìn)牛、羊、雞、豬、猴等動(dòng)物血清中GH中含量的升高，至今未見(jiàn)有關(guān)其毒副作用方面的報(bào)導(dǎo)。另外，發(fā)現(xiàn)靜脈注射醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2的效果比皮下注射好；口服醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2利用率不高，但也有一定的活性（靈長(zhǎng)類對(duì)GHRP最為敏感）；鼻腔給藥利用率大大提高，為靜脈注射的34％-45％，如此高的利用率是其他肽類藥物所不能比的，這大概與醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，其序列中兩個(gè)D型氨基酸有效地抑制了蛋白水解酶的識(shí)別和降解。這說(shuō)明醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2具有很強(qiáng)的口服或鼻腔內(nèi)服用潛力，在將來(lái)的臨床應(yīng)用中，既可減輕病人的痛苦，也將提供極大的方便。

合成方法

1、氨基酸樹(shù)脂的制備 

DMF沖洗反應(yīng)柱，加入0.872g（0.5mmol）的Rink-Amide-AM樹(shù)脂，加DMF通氮?dú)馊苊?0min，抽掉DMF，加入6mL的DBLK溶液脫去樹(shù) 脂上的Fmoc保護(hù)基，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)5min，抽干，加入少量DMF洗滌一次，再加入6mL DBLK溶液，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)10min，抽干，取少許樹(shù)脂做茚三酮檢測(cè)，樹(shù)脂呈現(xiàn)藍(lán)色，表示Fmoc保護(hù)基已脫去，DMF洗滌 三次，DCM洗滌兩次。脫保護(hù)間隙，將0.958g（2mmol）Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、0.284g（2mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加入0.31ml（2mmol）DIC活化7min。將澄清的氨基酸溶液投入 反應(yīng)柱內(nèi)，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)2.5h，抽干，加6mL的DMF洗滌兩次，抽干，用DCM洗滌一次，抽干，再用DMF洗滌兩次。茚檢樹(shù)脂為白色，表示反應(yīng)完全，制得Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am樹(shù)脂。

2、替代度的測(cè)定 

精確稱取兩份干燥的Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am樹(shù)脂各10mg，倒入2mL離心管中，標(biāo)號(hào)（1、2），分別加入1mLDBLK溶液，在室溫下振搖20min，脫去Fmoc保護(hù)基。用移液槍依次從兩離心管中各取出200μL溶液至10mL比色管中，標(biāo)號(hào)（1、2），用DMF稀釋，搖勻待測(cè)。用移液槍取200μL的DBLK溶液至10mL比色管中，用DMF稀釋，搖勻，作為空白對(duì)照液。紫外分光光度計(jì)在301nm處測(cè)定兩份溶液的吸收值A(chǔ)₁=0.563A，A₂=0.582A。兩份Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am樹(shù)脂替代度的平均值為Sub=0.469mmol/g。

3、封閉反應(yīng) 

向反應(yīng)柱內(nèi)加入11mL封閉液，封閉20h。用DMF、DCM各交替洗滌三次，抽干，加入8mL甲醇收縮樹(shù)脂，氮?dú)獯捣?min，抽干，再加8mL甲醇氮?dú)獯捣?min，抽真空至干燥，稱量得0.971g。

4、接肽反應(yīng)（醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2樹(shù)脂的制備） 

稱量0.97g（0.45mmol）的Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am樹(shù)脂投入反應(yīng)柱內(nèi)，加入8mLDMF氮?dú)獯捣飨氯苊?0min，抽干，加6mL的DBLK溶液脫保護(hù)兩次（5+7min），抽干，DMF洗滌三次，DCM洗滌兩次，茚檢，樹(shù)脂顯示深藍(lán)色。在脫保護(hù)基間隙，將稱量的0.705g（1.8mmol） Fmoc-D-Phe-OH、0.251g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。將活化好的澄清溶液倒入反應(yīng)柱內(nèi)，用少許DMF沖下掛壁的樹(shù)脂，調(diào)整氮?dú)饩鶆虼捣鞣磻?yīng)2h，茚檢樹(shù)脂呈白色。抽去反應(yīng)液，加DMF、DCM交替洗滌三次，每次1min左右。

加6mL的DBLK溶液脫保護(hù)2次，一次反應(yīng)5min，一次反應(yīng)7min，之間用少量DMF洗滌一次。茚檢，樹(shù)脂顯深藍(lán)色，DMF洗滌三次，DCM洗滌兩次。將預(yù)先配制好的0.948g（1.8mmol）Fmoc-L-Trp(Boc)-OH和 0.264g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。加至反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)2h。樹(shù)脂茚檢顯白色，DMF洗滌三次，每次1min左右，DCM洗滌兩次，抽干。

加6mL DBLK反應(yīng)5min，DMF洗滌1min，再加DBLK反應(yīng)7min， 取少量樹(shù)脂做茚檢顯深藍(lán)色，DMF、DCM交替洗滌三次。將預(yù)先稱量好的0.597g（1.8mmol）Fmoc-Ala-OH和0.258g（1.8mmol）HOBt用2mL的DMF溶解，加入0.28ml（1.8mmol）的DIC，冰浴下活化5-7min。將活化好的澄清溶液加至反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)2.5h。茚檢顯白色，加 DMF反復(fù)洗滌四次，每次1min左右，之間用DCM洗滌一次，抽干。 

加6mL的DBLK溶液脫保護(hù)兩次（5+7min），DMF洗滌一次。茚檢顯深藍(lán)色，DMF、DCM交替洗滌三次。將稱量好的0.786g（1.8mmol） Fmoc-D-βNal-OH和0.257g（1.8mmol）HOBt倒入燒杯內(nèi)，用2mL的DMF溶解后，冰浴下加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min后加至反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣鞣磻?yīng)2h。茚檢白色，加DMF反復(fù)洗滌三次，DCM洗滌兩次，抽干。 

加DBLK溶液脫保護(hù)兩次，一次反應(yīng)5min，一次反應(yīng)7min，之間用DMF洗滌一次。茚檢樹(shù)脂顯深藍(lán)色，DMF洗滌三次，DCM洗滌兩次。將預(yù)先稱量好的0.605g（1.8mmol）Fmoc-D-Ala-OH、0.25g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。加至反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣飨路磻?yīng)2h。取少量樹(shù)脂做茚檢顯示白色，抽干，加6mL的DMF洗滌兩次，每次1min左右，抽干，用DCM 洗滌一次，抽干，再用DMF洗滌兩次。加入6mL的DBLK溶液脫保護(hù)反應(yīng)5min，用DMF洗滌一次，再加DBLK溶液反應(yīng)7min，DMF洗滌三次。DCM洗滌兩次，每次1min，抽干，茚檢顯紫紅色，加入10mL甲醇收縮樹(shù)脂兩次（5+5min），抽真空至恒重。醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2樹(shù)脂稱重得1.185g。 

5、醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2樹(shù)脂的切割

從冰柜中取出所用切割試劑，在室溫下使TFA、苯甲硫醚、間甲酚等試劑解凍，按體積比配好兩種切割配方，放置冰浴中備用。 

切割試劑A：TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚（9:0.5:0.3:0.2）；  

切割試劑B：TFA:EDT:間甲酚（9.5:0.4:0.1）; 

稱量?jī)煞?00mg的GHRP-2肽樹(shù)脂，分別裝入2mL的離心管內(nèi)，標(biāo)號(hào)，用移液槍分別加入1mL切割試劑A、B， 密封，拿冰塊包裹控制溫度0℃搖振反應(yīng)0.5h，去除冰袋，放置30℃搖床中繼續(xù)振蕩反應(yīng)1h。取出離心管，用棉球?yàn)V過(guò)反應(yīng)液，濾除樹(shù)脂，將濾出的液體倒入盛有10ml冰乙醚的離心管中，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，4000轉(zhuǎn)/min離心機(jī)離心3min，倒出上清液，加10mL冰乙醚再次離心，重復(fù)三次。最后一次離心后，倒出上清液，抽真空干燥過(guò)夜。得到白色固體或淡黃色凝膠狀固體即醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2粗品。密封，冷藏保存。

6、醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2分離純化

用半制備反相高效液相的純化條件為：半制備柱Hedera ODS-2反相硅膠柱（20×250mm，10μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；流動(dòng)相A相： 0.01%TFA/H₂O；B相：CH₃CN；采用梯度洗脫方式：B相25%-55%，洗脫時(shí)間30min；流速為8ml/min。取醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2粗肽8mg溶于3mL無(wú)氧水中，進(jìn)樣，分段收集主峰，減壓旋蒸除去微量乙腈、TFA等，預(yù)凍一夜，經(jīng)冷凍干燥得到白色絮狀固體醋酸生長(zhǎng)激素釋放肽-2純品。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭霄. 生長(zhǎng)激素釋放肽的固相合成[D].承德醫(yī)學(xué)院,2013.

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