背景[1-3]
5-甲酰環(huán)連接酶抗體是一類可以特異性結合5-甲酰環(huán)連接酶的多克隆抗體，主要用于體外檢測5-甲酰環(huán)連接酶的免疫學實驗。
葉酸作為介導一碳代謝的重要輔因子,參與生物體內的多種代謝活動。5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶(5FCL)被報道催化貯存形式的5-甲酰四氫葉酸(5-CHO-THF)向代謝活性形式的葉酸轉化。
5-甲酰環(huán)連接酶
葉酸及其類似物甲酰四氫葉酸，常以多聚谷氨酸結合物（主要有碟酰三谷氨酸及碟酰七谷氨酸）的狀態(tài)廣泛分布于生物中，在正常情況下，它們皆可被小腸上皮細胞分泌的γ-L谷氨酸-羥基肽酶水解成谷氨酸和自由葉酸，自由型葉酸在小腸上部易于吸收，在體內的腸壁、肝、骨髓等組織中，在維生素C和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的參與下，葉酸可以轉變?yōu)榫哂猩砘钚缘?,6,7,8-四氫葉酸，其反應由葉酸還原酶來促進。
抗體是可溶性Y形球蛋白，響應于抗原的存在，由免疫系統(tǒng)的B細胞合成和分泌。具有可變區(qū)和高可變區(qū)的抗原結合位點（Fab）通常不考慮綴合，因為這會干擾表位的結合。而且，在鉸鏈區(qū)的破壞使分子具有結合的靈活性，可能破壞抗原相互作用。因此，在制備抗體-綴合物時，必須盡可能保持Fab和鉸鏈區(qū)不受干擾。
迄今為止，鑒定出的所有五類抗體-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，診斷和治療。
應用[4][5]
用于結核分枝桿菌葉酸代謝相關基因Rv0992c的性質及功能研究
通過生物信息學方法對M.tuberculosis H37Rv的未知功能基因Rv0992c的蛋白產(chǎn)物進行結構和功能的分析及預測,并對該基因進行克隆、表達及蛋白產(chǎn)物酶學活性研究。從之前對深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）的研究得知RruA1084基因編碼5-甲酰基-四氫葉酸環(huán)連接酶（5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase,也稱為次甲基-四氫葉酸合成酶,MTHFS）。
M.tuberculosis中Rv0992c基因是Rru A1084的同源物（二者的氨基酸序列具有32.7%的相似性和21.8%的同源性）,所以推測前者編碼結核分枝桿菌的5-甲?；?四氫葉酸環(huán)連接酶。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得M.tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列,設計對引物,以M.tuberculosis H37Rv全基因組為模板,PCR擴增獲得Rv0992c基因。通過TA克隆,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector上,之后亞克隆至載體pET28上,經(jīng)菌落PCR,質粒酶切以及核苷酸序列測序證明了成功的構建了重組質粒pET28-Rv0992c。
重組質粒轉化Escherichia coli BL21（DE3）,以溫度、時間和IPTG濃度建立三因素三水平的正交實驗,優(yōu)化該重組蛋白質誘導表達條件。以表達條件（0.8mM的IPTG,25℃下誘導4h）進行擴大培養(yǎng),Ni+凝膠親和層析柱純化獲得高純度的重組Rv0992c蛋白。純化蛋白的酶學活性通過反應產(chǎn)物5,10-次甲基-四氫葉酸在355nm處吸光度的變化得到證實。運用Vector NTI 9,Swiss Model等生物信息學資源對結核分枝桿菌Rv0992c編碼蛋白的基本性質進行了分析,包括對蛋白質等電點和分子量的預測,二級結構以及三級結構的預測分析。
結果表明：M.tuberculosis H37Rv Rv0992c基因編碼蛋白分子量為21412.95Da,理論PI為9.40；二級結構是由3個α螺旋8個β折疊及無規(guī)則卷曲構成的。在一二級結構分析的基礎上,利用同源建模的方法完成了其三維結構的建模。分析該蛋白在分枝桿菌屬中的分布情況,結果顯示M.tuberculosis H37Rv的MTHFS同已報道的其他分枝桿菌屬來源的MTHFS有較高的同源性。
綜上,本研究揭示了M.tuberculosis H37Rv Rv0992c序列編碼蛋白具有將5-甲酰-四氫葉酸轉化為5,10-次甲基-四氫葉酸的生物學功能。
參考文獻
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