背景^[1][2][3]

單克隆抗體技術(shù)起源于Kohler等創(chuàng)建的體外鼠源雜交瘤技術(shù)。經(jīng)多年研究，鼠單抗已從單純的生物實(shí)驗(yàn)室科研及臨床診斷發(fā)展到治療性抗體藥物。但鼠單抗的主要缺陷是小鼠免疫系統(tǒng)不能識(shí)別某些免疫原，尤其是鼠源性的免疫原，而且鼠單抗的親和性不如兔來源抗體的親和性高。

然而由于沒有發(fā)現(xiàn)兔源性的漿細(xì)胞瘤及病毒體外轉(zhuǎn)染兔B細(xì)胞的技術(shù)困難，直到1995年在c-myc/v-abl轉(zhuǎn)基因兔身上成功地獲得了兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系，得到了穩(wěn)定的兔-兔雜交瘤，才使兔單克隆抗體技術(shù)有了突破性進(jìn)展。近年兔單克隆抗體技術(shù)日臻完善，目前商品化的兔單抗已達(dá)數(shù)千種。

Apaf-1是一種分子量為130kD的蛋白質(zhì)，其存在于細(xì)胞質(zhì)中。人Apaf-1基因位于染色體12q23。Apaf-1 由三部分特殊的結(jié)構(gòu)域組成：①N-末端為85 個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶募集域，稱為CARD結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合N端具有同源性的caspase-9。②是和CED-4有很高同源性，含320個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域，CED-4同源域內(nèi)包含一個(gè)保守的P環(huán)，與dATP/ATP結(jié)合，可促進(jìn)自身的多聚化。③C-末端有12個(gè)WD-40重復(fù)片段，其阻礙自身多聚化，當(dāng)它與細(xì)胞色素c結(jié)合，改變Apaf-1的構(gòu)象，消除了對(duì)Apaf-1自身多聚化的阻礙作用，使Apaf-1與procaspase-9結(jié)合并啟動(dòng)其活化過程。

Apaf-1廣泛存在于各種組織里，其中以成人脾、外周血白細(xì)胞及胚胎腦、腎、肺的表達(dá)較高，與這些組織內(nèi)高水平的凋亡率相一致?，F(xiàn)有多種Apaf-1cDNA基因已被證實(shí)，包括Apaf-1L，Apaf-1XL，Apaf-1M，Apaf-1XS和Apaf-1 -ALT等。

目前，已發(fā)現(xiàn)與最初克隆的Apaf-1cDNA(原始類型)相比，Apaf-1L和Apaf-1XL異構(gòu)體都具有一個(gè)13 W D-40 重復(fù)，但Apaf-1XL在CARD和ATPase結(jié)構(gòu)域之間還有一插入序列推斷在K562細(xì)胞中這種結(jié)構(gòu)可能降低Apaf-1募集caspase-9 前體的能力，從而造成有活性的caspase-9 減少，最終影響caspase-3 的活性。

Apaf-1兔單克隆抗體識(shí)別總Apaf-1蛋白質(zhì)的內(nèi)源性水平?；诿庖咴噪牡陌被嵝蛄?，期望抗體識(shí)別所有Apaf-1同種型。p73兔單克隆抗體是通過用對(duì)應(yīng)于人Apaf-1蛋白的殘基的合成肽免疫動(dòng)物而產(chǎn)生的。Apaf-1兔單克隆抗體可用于分子印跡分析。

應(yīng)用

1. 在生物標(biāo)記物開發(fā)中的應(yīng)用

兔單克隆抗體包括Apaf-1兔單克隆抗體廣泛用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，尤其在免疫組織化學(xué)以及檢測(cè)蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。至今已有100多種兔單克隆抗體開發(fā)用于癌癥的IHC臨床診斷與研究，其中最具代表性的就是Her2和c-Kit的IHC診斷試劑盒。在蛋白修飾研究領(lǐng)域，如蛋白的磷酸化，在與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)信號(hào)通路中起到了至關(guān)重要的作用，使用磷酸化蛋白的兔單克隆抗體可以非常清楚地顯示蛋白的磷酸化程度。目前已有200多種磷酸化特異性的兔單克隆抗體面世。

2. 在治療抗體藥物開發(fā)中的應(yīng)用

臨床使用的大多數(shù)治療用抗體均需經(jīng)體外親和力成熟這一步驟，以提高抗體的親和力。這一過程常需8至12個(gè)月，最終親和力在納摩爾級(jí)(10-9 mol/L)。兔單抗不需使用體外親和力成熟，就能達(dá)到10-11至10-13 mol/L。這種高親和力不僅減少抗體的臨床使用量，還能減少由于使用大量抗體帶來的副作用。但這種高親和力的優(yōu)勢(shì)還需在動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

另外，與鼠單抗的人源化相比，兔單克隆抗體的人源化更容易。因?yàn)?，兔單克隆抗體主要由一種重鏈及輕鏈基因構(gòu)成，通過分析大量的兔單克隆抗體序列發(fā)現(xiàn)，兔與人的抗體同源性更高，約60%～76%，而小鼠與人的抗體同源性略低，為57%～72%，說明用兔單克隆抗體開發(fā)藥物前景更廣闊。

主要參考資料

[1] 李婷婷，崔慧斐. 兔單克隆抗體的發(fā)展及應(yīng)用前景[J]. 食品與藥品，2012，14(9)： 373-376. 

[2] Zou H, Li Y, Liu X, et al. An APAF-1· cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(17): 11549-11556.

[3] 尤程程, 黃利鳴. Apaf-1 研究進(jìn)展及展望[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2008, 29(4): 686-688.