背景^[1-3]

巧克力血瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)用于奈瑟球菌、流感嗜血桿菌的培養(yǎng)，需添5%~10%加脫纖維羊血(無菌脫纖維綿羊血)。奈瑟菌屬（Neisseria）是一群革蘭染色陰性雙球菌，是β-變形菌類的一屬無芽孢，無鞭毛，有菌毛，專性需氧，氧化酶陽性。奈瑟菌呈球形，成對排列，形似咖啡豆的革蘭陰性球菌，通常位于中性粒細(xì)胞內(nèi)，而在慢性淋病時常位于細(xì)胞外，新分離株有莢膜和菌毛。奈瑟球菌是人類淋病的病原菌。主要引起人類泌尿生殖系統(tǒng)粘膜的急性或慢性化膿性感染，是我國流行的發(fā)病率最高的性傳播疾病。

巧克力血瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)

奈瑟球菌菌體較小，直徑為0.6～1.0微米的腎形球菌，常成雙排列。無芽胞，無鞭毛，少數(shù)有莢膜。需氧或兼性厭氧，發(fā)酸能力弱，有氧化酶，不形成吲哚，不還原硝酸鹽。DNA中的G+C克分子含量為47～52%，寄生于哺乳動物的粘膜上。

流感嗜血桿菌是一種沒有運動力的革蘭氏陰性桿菌。它是于1892年由費佛博士在流行性感冒的瘟疫中發(fā)現(xiàn)。它一般都是好氧生物，但可以成長為兼性厭氧生物。

流感嗜血桿菌最初被誤認(rèn)為是流行性感冒的病因，但直至1933年，當(dāng)發(fā)現(xiàn)流行性感冒的病毒性病原后，才消除了這種誤解。不過，流感嗜血桿菌仍會導(dǎo)致其他不同種類的病癥。

配制方法：稱取本品43克，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，于90℃左右，加入5-10%無菌脫纖維羊血，搖勻，繼續(xù)加熱保溫，邊加熱邊搖動，直至分層，冷至50℃左右，搖勻，傾注平板。

成分(g/L)：蛋白胨15.0g；酵母浸粉4.0g；；氯化鈉5.0g；牛肉浸粉4.0g；瓊脂15.0g；PH值:7.2±0.2，25℃。

應(yīng)用^[4][5]

用于副豬嗜血桿菌Ⅳ型菌毛的初步研究及pilA突變株的篩選研究

克隆并分析了菌毛操縱子的序列參照HPS SH0165全基因組序列,設(shè)計引物并克隆Ⅳ型菌毛操縱子序列,通過序列分析發(fā)現(xiàn)操縱子的結(jié)構(gòu)基因由四個ORF組成,分別為pilA、pilB、pilC和pilD,分別編碼170、462、399和222個氨基酸,通過基因序列分析發(fā)現(xiàn),HPS17株標(biāo)準(zhǔn)菌株中pilA的序列同源性在85%以上,而且基因的保守性較高,而標(biāo)準(zhǔn)菌株pilB、pilC和pilD的序列同源性均在40%-50%左右。

對其蛋白序列進行比對分析,發(fā)現(xiàn)pilA基因與相近種屬的有關(guān)基因相似性較高。另外,PilA蛋白羧基端擁有相對保守的半胱氨酸殘基,該位點能夠形成二硫鍵并產(chǎn)生一個環(huán)形結(jié)構(gòu),在Ⅳ型菌毛發(fā)揮功能時起到重要作用,而且是主要的抗原決定部位。

PilA蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備以SH0165菌株的基因組DNA為模板,設(shè)計引物擴增pilA片段,將pilA與pET-28a連接轉(zhuǎn)化E.coli/BL21（DE3）菌株并進行原核表達(dá)。利用透析的方法對表達(dá)在包涵體中的PilA蛋白進行純化,利用純化好的蛋白免疫BALB/c鼠進行多克隆抗體的制備。間接ELISA和Western-blot分析表明抗體特異性良好,其中較高的效價為1：51200,可用于后續(xù)研究使用。

菌毛在不同環(huán)境下的表達(dá)情況本研究嘗試使用多種培養(yǎng)基來實現(xiàn)菌毛的體外表達(dá),如使用LB培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基以及化學(xué)成分限定培養(yǎng)基來培養(yǎng)HPS,但通過電鏡觀察均未觀察到菌毛的存在。使用細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng)的方法,試圖誘導(dǎo)HPS菌毛的表達(dá),未能達(dá)到預(yù)期結(jié)果。另外,將HPS在雞胚絨毛尿囊膜上傳代后進行細(xì)菌的電鏡觀察,也未能觀察到菌毛的存在。用副豬嗜血桿菌感染健康豬,采集感染豬血清及各發(fā)病組織,從胸水中分離的細(xì)菌通過電子顯微鏡,觀察到了菌毛結(jié)構(gòu)的存在。

參考文獻(xiàn)

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